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抗生素在临床的应用已有半个世纪,在防治感染性疾病保障人类健康和养殖业持续发展做出巨大贡献的同时,耐药性问题已引起全球高度重视。在持续抗菌药压力环境下,细菌适应不利环境得以生存而发生变异是符合达尔文进化论。因此探讨细菌在抗菌药压力下随时间变迁而发生变异规律,为阐明病原菌致病机制、控制感染和耐药性产生、开发新型疫苗和药物提供理论依据。本研究拟利用动态模型模拟养殖场环境中抗菌药压力,探讨不同抗菌药压力对不同血清型大肠杆菌生长分布的影响及耐药性产生机制。
研究中所用模型是自制的细菌连续动态培养模型,两个受试菌是不同血清型的大肠杆菌O2和O78,均为野生敏感菌。利用叠氮钠和利福平用体外连续诱导的方法分别对O2和O78进行抗性标记,最终O2标记为叠氮钠抗性O2AziR,O78标记为利福平抗性O78RifR。O2AziR和O78RifR单独或混合输入模型中在无抗菌药作用下连续培养,观察两株菌的生长差异。然后人为地向动态模型中添加不同组合的抗菌药,在0、2、4、6、8……44、46、48h等不同时间点采样考察不同抗菌药压力下两种不同血清型细菌生长分布的改变。抗菌药压力组合包括,阿莫西林+黏菌素,阿莫西林+环丙沙星,氨苄西林+环丙沙星,替米考星+黏菌素,氟苯尼考+黏菌素,链霉素+环丙沙星,环丙沙星单药。结果表明在不同抗菌药组合选择压力下大肠杆菌O78RifR更具有适应性而生长良好,成为动态模型小环境中的优势血清型;而仅在环丙沙星单药选择压力下O2AziR生长明显优于O78RifR成为优势菌,说明不同抗菌药选择压力导致临床血清型分布的多样性。用微量肉汤稀释法对不同抗菌药压力下筛选的两种菌的诱导耐药菌进行MIC测定,结果表明各诱导耐药菌都对选择压力抗菌药及其同类药物都产生耐药,而且也可能选择出非抗性选择抗菌药的耐药菌株。对各种抗菌药压力下的O2AziR和O78RifR耐药菌株(第48小时样本)进行相关耐药基因或基因突变的调查,结果显示在不同抗菌药压力组合下两株菌中氨基糖苷类抗菌药钝化酶基因aadA1、aadA2的检出率最高,几乎在所有的菌株中都能检测到,其次是aac(3)-Ⅱc,aac(3)-Ⅳ,这些基因的出现与链霉素压力无关,即非氨基糖苷类抗菌药压力下也能筛选出上述4种基因。有趣的是在阿莫西林+环丙沙星压力下O78RifR和阿莫西林+黏菌素压力下O2AziR中检出rmtB基因。链霉素+环丙沙星药物压力下O78RifR和O2AziR都检测了1类和2类整合酶基因,而阿莫西林+环丙沙星药物压力下O78RifR和O2AziR只检出了1类整合酶基因。在环丙沙星组合压力下所有耐药菌都在gyrA基因的第83位氨基酸上出现Ser→Leu的突变,gyrB基因的第492位氨基酸发生Ser→Asn的突变,parC,parE没有发现可引起氨基酸变化的突变位点。在氟苯尼考+黏菌素压力下O78RifR gyrB基因的第492位氨基酸发生了Ser→Asn的突变。对环丙沙星耐药菌株进行外排泵确证实验,结果表明所有耐药菌株在添加外排泵能量抑制剂后都恢复了对环丙沙星和恩诺沙星的敏感性。
本研究表明在不同抗菌药压力下大肠杆菌O78为优势血清型,抗菌药压力下细菌对抗性选择抗菌药及同类药物都产生耐药,并且发生基因水平的改变,导致细菌产生耐药性。不同抗菌药压力组合下两种细菌都能产生氨基糖苷类抗菌药钝化酶基因。在阿莫西林+环丙沙星和阿莫西林+黏菌素压力下可诱导两种不同血清型大肠杆菌产生rmtB基因。短暂抗菌药压力下外排泵的过度表达是导致细菌对氟喹诺酮类产生耐药性的主要机制。