【摘 要】
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通过因特网从Genebank中找到Tth DNA聚合酶基因序列,利用Pinmer4软件对其内切酶位点进行分析,并设计了两组引物进行PCR,分段克隆该基因,用PstI分别对PCR产物酶解,结果所得的D
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通过因特网从Genebank中找到Tth DNA聚合酶基因序列,利用Pinmer4软件对其内切酶位点进行分析,并设计了两组引物进行PCR,分段克隆该基因,用PstI分别对PCR产物酶解,结果所得的DNA片段与计算机分析的完全一致.分别把两个片段过接到pGEM-T质粒上得pJYQ-T1和pJYQ-T2质粒,用AflⅡ和SalI分别酶切pJYQ-T1,pJYQ-T2,回收纯化所需片段进行连接,拼接成完整的TthDNA聚合酶基因,得到质粒pJYQ-T3.以pJYQ-T3为模板,通过PCR扩增得TthDNA聚合酶基因.以Bg1Ⅱ和EcoRI酶切PCR产物,以BamHI和EcoRI酶切pET-5a,用T4 ligase把该基因连接到pET-5a上,并转化BL21(DE3)pLysS.培养转化了pET-5a:Tth的BL21(DE3)pLysS,加入IPTG诱导,收集细胞并用溶酶破碎,用粗提液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达蛋白的分子量大小,并以它作为酶源进行PCR,测定该酶活力.
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