论文部分内容阅读
Ran (Ras-like nuclear protein)是真核细胞核内含量丰富的小分子GTP酶蛋白。Ran蛋白作为重要的细胞增殖调控因子,能够与不同的调控因子和效应分子相互作用,表现出细胞功能的多样性,包括：调节核物质转运、核膜装配、纺锤体组装、DNA复制、RNA转录、mRNA加工和运输及细胞周期调控等。不同生物中的Ran同源物在有丝分裂、减数分裂及细胞凋亡过程中的功能存在差异,因此对不同物种中Ran蛋白的深入研究有助于进一步阐明该类蛋白新的生物学功能。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种单细胞真核生物,属于纤毛类原生动物,在单个细胞内集中了维持生命和延续后代所必需的一切功能,具有精细的细胞周期进程和复杂的核发育过程,是研究蛋白功能理想的模式体系。四膜虫生命过程中可经历无性生殖和有性生殖两种生殖周期。在无性生殖期,大核进行无丝分裂,尽管没有纺锤体形成,但核内微管重新组装排列成特定形式以帮助大核分裂。在有性生殖阶段,随着新小核和新大核发育形成,亲本大核通过程序性核死亡(programmed nuclear death, PND)的途径退化。四膜虫中这种独特的核分裂方式及核发育过程的分子调控机制目前并不清楚。本实验对Ran蛋白在嗜热四膜虫大核无丝分裂和亲本大核程序性死亡过程中的调控功能进行研究,获得如下结果：1.四膜虫RAN1基因的生物信息学分析RAN1是嗜热四膜虫中Ran蛋白编码基因,全长1443bp,编码225个氨基酸,拟编码蛋白质Ranl预测分子量为25.6kD。Ran1氨基酸序列与已报道的动、植物Ran蛋白序列有较高的一致性；系统进化分析结果表明,四膜虫Ranl与草履虫中Ran的进化关系最近。四膜虫Ran1蛋白包含小GTPase蛋白共有的GDP/GTP结合区和开关结构域,以及Ran蛋白亚家族特有的辅助调控蛋白结合位点和酸性C-末端序列。RAN1基因在四膜虫整个生命周期中都有较高的表达水平。分析Ran1各辅助调控蛋白的功能结构域时发现,它们与其它物种该蛋白同源物的序列存在差异,暗示Ranl在四膜虫中可能存在与其同源蛋白类似但有差别的功能。2.Ran1调控四膜虫无性生殖中大核无丝分裂过程带有HA标签的野生型Ran1以及模拟GDP、GTP锁定形式的Ran1突变体,Ran1T25N和Ran1Q70L在四膜虫无性生殖细胞周期表现出不同的大核定位模式,且Ranl蛋白上各调控因子结合结构域在不同形式Ran1的特异性大核定位中发挥各自不同的功能。通过同源重组敲除RAN1基因,并筛选获得RAN1基因部分敲除细胞株i△RAN1.i△RANl细胞表现出繁殖速度下降及大核无丝分裂异常。通过免疫荧光分析发现,部分敲除RAN1基因导致无丝分裂各时期大核内微管排列形式紊乱,从而使得复制的大核染色体不能分开,最终导致大核增殖受阻。过表达RanlWT/T25N/Q70L扰乱Ran1循环,进而影响大核无丝分裂进程并导致繁殖速度下降,且RAN1及其突变基因的过表达量与异常无丝分裂核型态细胞比例呈正相关。过表达Ran1T25N相比过表达Ran1WT和Q70L对无丝分裂和大核内微管组装的抑制效应更加明显。过表达Ran1及其突变体蛋白破坏了正常的Ranl分布形式。本实验结果表明,四膜虫中Ran GTPase可能通过Ran1GDP/GTP循环的形式,参与调控大核内微管网络的精确重排,从而调控大核无丝分裂进程。3.Ranl调控四膜虫有性生殖中亲本大核程序性核死亡过程本研究首先分析敲除RAN1基因对四膜虫接合生殖过程核发育和某些细胞核PND进程的影响,发现接合早期时核发育正常,接合中晚期3个小核减数分裂产物和亲本大核的PND进程受到抑制。而当RAN1部分敲除细胞与RAN1过表达细胞接合配对时,PND抑制得到一定程度的恢复。免疫荧光分析HA-Ranl WT/T25N/Q70L在四膜虫有性生殖过程中的动态定位模式,尤其是在亲本大核PND过程中的定位,表明Ran1GDP/GTP循环可能发生在PND的亲本大核的核质屏障两侧。同时分析Ranl蛋白是否参与调控凋亡促进因子(Apoptosis-inducing factor, AIF)在亲本大核PND过程由线粒体向亲本大核转移。部分敲除RAN1基因抑制AIF向PND的亲本大核转移,并且Ran1GDP和Ran1GTP分别促进和抑制AIF的核输入,表明Ran1GDP/GTP循环可能参与调控AIF向PND的亲本大核运输。最后构建了将AIF靶向到亲本大核的人工系统,即不依赖于Ranl而由improtin a介导的AIF核输入系统。利用该系统将AIF主动输入到i△RAN1细胞的亲本大核中,发现i△RAN1配对细胞的亲本大核PND进程得到一定程度的恢复,但3个小核减数分裂产物的PND异常没有恢复,表明AIF是亲本大核PND进程中重要的效应因子。这些结果表明,Ranl可能通过调节AIF向亲本大核的输入来调控亲本大核的程序性死亡过程。本研究首次对Ran1蛋白在原生动物细胞中的定位和功能进行了系统研究,表明Ranl调控嗜热四膜虫无性生殖期大核无丝分裂过程,并通过AIF信号通路在有性生殖期亲本大核程序死亡过程中发挥重要作用,说明Ran GDP/GTP循环是普遍存在于真核细胞中的保守的调控机制。