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心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是指心肌组织中胶原纤维过量堆积,胶原蛋白含量明显升高或胶原蛋白成分发生改变,主要表现为心肌成纤维细胞增殖并分泌大量胶原蛋白。心肌纤维化是多种心脏血管疾病的共同病理改变,是心室重构的主要表现之一,可导致心室舒张功能异常、心脏电生理紊乱、心律失常,终末期可因冠状动脉储备显著下降而导致猝死。近年来,减缓或逆转心肌纤维化已成为当前治疗高血压及慢性充血性心力衰竭的重要目标之一。目前,心肌纤维化的发病机制尚不清楚,其特异性防治药物也亟待进一步发展。小RNA(microRNAs,mi RNAs)是一段22~25个核苷酸的非编码单链RNA,它通过与下游靶基因的3’非编码区(untranslated region,UTR)发生特异性结合,参与细胞的生长,属转录后调节。已有研究提示一些miRNAs在心脏重构中表达异常,但mi RNAs在心肌纤维化过程中的表达变化规律及作用机制尚待进一步研究。在心肌纤维化等心脏重构过程中,鸟苷酸结合蛋白Gq处于核心地位,多种导致心脏重构的主要信号通路都通过与Gq蛋白相偶联而激活下游信号。十余年来,本实验室研究开发了Gq蛋白α亚单位羧基末端模拟肽汇利心康(HLXK),已在多种动物和细胞模型中证实,具有良好的抗心肌肥大作用。本研究拟在我们预实验工作的基础上,开展HLXK防治心肌纤维化与miRNA的关系研究,旨在为深化对HLXK防治心肌纤维化机制的认识和寻找新的有效分子靶标提供实验基础。方法:1.雄性SPF级昆明小鼠,采用去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE 1.5mg/kg)制备心肌纤维化模型,连续20天;用5mg/kg的氯沙坦作为阳性对照;HLXK组在给予去甲肾上腺素的同时给予HLXK(30μg/kg,90μg/kg)。给药后第21天,处死小鼠,称量并计算左心室质量指数;每组取6只小鼠的左心室组织,置于4%多聚甲醛中固定2天后,苦味酸-天狼星红染色,观察小鼠左心室心肌组织胶原纤维变化;每组取6只小鼠左心室组织,精确称取湿重后,试剂盒检测小鼠左心室组织羟脯氨酸含量。HE染色观察小鼠左心室心肌组织形态学变化。采用RT-q PCR方法,检测小鼠左心室组织mirna表达变化。2.离体培养大鼠心脏成纤维细胞中,给予终浓度为1×10-7mol/l的angⅡ造模,并检测hlxk对angⅡ诱导的心脏成纤维细胞中mirna的表达变化的影响,分别观察hlxk和mir-199对成纤维细胞胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ基因和蛋白表达水平的影响,转染mir-199inhibitor或者mimic,观察mir-199对心脏成纤维细胞中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ基因和蛋白表达变化的影响。3.离体培养大鼠心肌细胞,给予终浓度为1×10-6mol/l的ne造模,检测hlxk对ne诱导的离体培养的心肌细胞mirna表达变化的影响,分别观察hlxk和mir-199对心肌细胞[3h]-亮氨酸掺入量的影响,转染mir-199inhibitor或者mimic,观察mir-199对心肌细胞[3h]-亮氨酸掺入量的影响。结果:1.造模第21天,模型组lvmi显著高于对照组;与模型组相比,90μg/kghlxk可显著降低模型组lvmi。苦味酸-天狼猩红染色发现,模型组心肌组织胶原纤维沉积显著增加(p<0.01),hlxk组的胶原纤维沉积较模型组明显减少(p<0.01);模型组小鼠左心室组织羟脯氨酸含量显著增加了24.66%,90μg/kghlxk可显著减少羟脯氨酸含量(p<0.01)。体外试验发现,与angⅡ模型组相比,30及90μg/kghlxk均可显著降低胶原蛋白Ⅰ基因和蛋白表达量(p<0.01),但对胶原蛋白Ⅲ基因和蛋白表达无明显影响。he染色表明,hlxk组心肌细胞排列基本整齐,心肌细胞纤维化明显减轻,未见明显的炎细胞浸润。在该动物模型中,模型组左心室中mir-199、mir-499和mirna-1-2-5p的表达显著增高,分别升高了731%、148%、242%;在给予hlxk防治心脏肥大的同时,也可明显抑制mirna表达增加(p<0.01)。2.在培养的离体心脏成纤维细胞中,给予终浓度1×10-7mol/langⅡ造模可显著上调心脏成纤维细胞mir-199的含量(p<0.01);同时给予hlxk11.3mg/l可显著抑制mir-199的基因和蛋白表达(p<0.01)。mir-199inhibitor可显著减少胶原蛋白Ⅰ基因和蛋白表达(p<0.01),仅转染mir-199mimic即可显著增加114.80%胶原蛋白Ⅰ的表达(p<0.01),而mir-199inhibitor对胶原蛋白Ⅲ基因和蛋白表达量影响不明显。3.在培养的离体乳鼠心肌细胞中,终浓度1×10-6mol/lne可显著增加心肌细胞[3h]-亮氨酸掺入,hlxk可显著降低ne导致的[3h]-亮氨酸掺入量30.5%,还可显著抑制ne升高的mir-499、mir-1-2-5p和mir-199的表达。30nmol/lmir-199inhibitor可显著减少ne导致的心肌细胞[3h]-亮氨酸掺入量的增加,而30nmol/lmir-199mimic可明显增加心肌细胞[3h]-亮氨酸的掺入量。结论:1.HLXK可减少模型动物心脏中I型胶原蛋白的生成,显著抑制心肌纤维化的发生。2.HLXK防治心肌纤维化及心脏重构的机制可能与其降低miR-199的表达改变有关。