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【研究背景】乌头属植物（Aconitium plants）是被子植物亚门毛茛科中一类重要的有毒植物,也是我国最早有记载的有毒植物之一;全世界已知的就有350种以上,主要生长在北半球温带地区;在国内,目前已被鉴定的约200余种,广泛分布于除海南以外的其他省区。乌头属植物及其制剂,在我国民间和传统中医治疗中已有二千多年的使用历史,疗效确切。现代药理学研究证实,乌头类药材大多具有抗炎消肿、麻醉止痛、强心降压、免疫抑制以及肿瘤抑制等广泛功效,有较高的药用价值。但该类药材,特别是其植物块根中,多含有剧毒的二萜类双酯型生物碱–乌头碱（aconitine）,其治疗量与中毒量或致死量接近,使用中因个体对乌头耐受性的差异、用法不当,以及误服或投毒等原因而发生中毒、甚至死亡的报道屡见不鲜。近年来在日本和欧美国家,利用乌头块根或乌头碱纯品服毒自杀或投毒他杀的案例也时有报道。乌头碱主要作用于神经系统和心脏。严重的心律失常,尤其是室速和室颤,是导致其中毒死亡的主要原因。以往运用离子通道结构分析和全细胞膜片钳技术等研究手段证实,乌头碱能与心肌细胞膜电压门控型Na+通道结合,抑制其失活,使Na+持续内流、延长细胞膜除极化时程而引发心律失常。但值得注意的是,近年来的实验和临床研究认为,心肌细胞间电耦联的失衡与心律失常的发生关系更为密切。因此,研究乌头碱对分离的单个心肌细胞离子通道的作用,不能全面反映其对作为功能性合胞体的心肌细胞群的整体结构和功能的影响。另一方面,有学者曾推测,既然乌头碱能作用于心肌细胞膜Na+通道,使Na+持续内流,那么在理论上,可能会通过Na+-Ca2+交换机制而导致胞内游离Ca2+浓度升高。因此有必要对乌头碱干预后,心肌细胞内游离Ca2+浓度变化做进一步研究。随着实验科学的不断发展,细胞培养技术因具有简便、可靠、可比性强和重复性好等优点,已被广泛应用于生物学和医学研究领域。体外培养的心肌细胞,不但保存了其结构和功能上的某些特点（如:自发性同步搏动）,还排除了机体神经、体液等各种复杂因素干扰,有利于从细胞和分子水平对心肌进行生理、病理、药理和毒理等多方面的研究。因此,体外心肌培养技术,可以用于在控制条件下（如:剂量、时间和染毒途径等）研究毒物对心肌细胞结构、功能和代谢等方面的影响,阐明毒物的毒性作用机制,在法医毒理病理学研究中值得应用和推广。【目的】1.建立体外培养条件下,不同剂量标准品乌头碱对新生大鼠心室肌细胞染毒的法医毒理学实验模型,从细胞学水平研究乌头碱对心肌细胞的毒性作用机制;2.测定不同剂量乌头碱染毒前后,培养的新生大鼠心室肌细胞缝隙连接蛋白Connexin43（Cx43）蛋白总量表达的情况,及磷酸化与非磷酸化Cx43亚型之间含量变化的规律;3.从蛋白磷酸化研究的角度,利用功能性抗体,在形态学水平,观察乌头碱染毒前后,心室肌细胞缝隙连接通道中,Cx43蛋白在其羧基端肽段特定氨基酸残基位点的磷酸化状态;4.运用荧光探针fluo-4 NW （no wash）游离Ca2+标记技术,实时动态检测乌头碱染毒前后,心室肌细胞内[Ca2+]振荡在幅度和频率上变化,对其变化机理进行分析;并进一步探讨乌头碱染毒后,心肌细胞内[Ca2+]振荡的变化与Cx43蛋白磷酸化状态改变之间的内在联系。【方法】1.体外培养条件下,新生大鼠心室肌细胞乌头碱染毒实验模型的建立选用SPF（Specific Pathogen Free）级,出生1～2 d的健康Sprague–Dawley大鼠（雌雄不拘）,每次取10只作心室肌细胞原代培养。于培养的第6 d更换无血清培养液维持12 h后,按相应的干预计划,对心肌细胞进行乌头碱染毒及后续检测,各批次实验均设立正常对照组。2.不同剂量乌头碱染毒前后,心肌细胞中Cx43总量及其磷酸化亚型含量的测定设立0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0μM/L共6个不同剂量的乌头碱染毒组,染毒1 h后,提取细胞膜蛋白,进行电泳分离,运用定量蛋白印迹分析技术,检测对照组及染毒后,心肌细胞Cx43蛋白总量及其磷酸化与非磷酸化亚型表达的变化。3.乌头碱染毒前后,心肌细胞Cx43蛋白羧基端肽段上特定位点磷酸化状态的观察选择抗磷酸化Cx43和抗非磷酸化Cx43两种功能性抗体,应用激光扫描共聚焦显微镜,结合细胞荧光图像定量分析技术,检测对照组和乌头碱染毒1 h后,心肌细胞Cx43蛋白在其羧基端第368位丝氨酸残基（Ser368）位点磷酸化状态的改变。4.乌头碱染毒前后,心肌细胞内Ca2+振荡变化的实时动态检测移除无血清培养液,向培养孔中加入空白或含一定浓度乌头碱的fluo-4 NW游离Ca2+荧光标记负载液,染毒1 h后,应用激光扫描共聚焦显微镜,选择二维平面扫描模式,在氩离子激光激发下,实时动态监测和记录染毒前后,心肌细胞浆和胞核内游离Ca2+振荡模式的变化。5.实验数据的统计学分析本实验采用SSPS统计软件（SSPS Inc., version 10.0, USA）,数据以X±S表示。在定量蛋白印迹分析实验中,选择单变量双因素方差分析（univariate two-way analysis of variance,ANOVA）,对正常对照组和各实验组Cx43蛋白总量及其各磷酸化亚型含量进行分析,组间均数的多重比较选用Games-Howell检验;各组之间,磷酸化与非磷酸化Cx43蛋白比值差异的比较,选用Kendall’s W协同系数检验。在免疫荧光检测实验中,选用嵌套设计的方差分析（nested ANOVA）,对正常对照组和各实验组P-Cx43 （Ser368）及NP-Cx43 （Ser368）阳性信号值之间的差异进行比较。认定P < 0.05时,组间均数有显著统计学差异。【结果】一、培养心肌细胞的形态、纯度,及其乌头碱染毒前后的细胞形态学比较1.倒置相差显微镜下观察:刚接种时的心肌细胞悬浮于培养液中,为均一、分散的圆形折光颗粒;12 h更换培养液时,细胞已开始贴壁生长,偶尔可见个别细胞自发搏动;培养24 h后,贴壁细胞互相连接呈稀疏网状,并出现缓慢的同步化搏动;48 h后,心肌细胞在培养孔底部进一步伸展,呈现快速同步化搏动的细胞单层,搏动频率约每分钟150 180次;2.培养第6 d,心肌细胞在培养孔底部充分伸展,形成稳定的同步化搏动细胞单层,频率约120次/min,选用抗心肌肌钙蛋白I （cTnI）特异性单克隆抗体,结合免疫荧光法检测培养物,证明绝大多数为心肌细胞;3.常规H.E.染色结果表明,与正常对照组比较,不同剂量乌头碱染毒后,心肌细胞形态结构未出现明显改变。二、不同剂量乌头碱对心肌细胞Cx43蛋白总量及其磷酸化亚型含量的影响1.兔抗总Cx43多克隆抗体可检测出Cx43蛋白条带的3种亚型,分子量大小为43、40和39 kDa,分别代表磷酸化P2带,磷酸化P1带和非磷酸化NP带。在正常对照组中,Cx43蛋白条带基本集中在43 kDa处（P2带）;碱性磷酸酶处理后,条带整体向前迁移到39 kDa处（NP带）;2.在染毒组中,0.25μM/L乌头碱干预后,Cx43条带开始向前弥散,出现P1带;乌头碱浓度提高到0.5μM/L时,NP带开始显现;当染毒浓度达到1.0μM/L后,NP带明显,但P2带和P1带显著变淡;1.5及2.0μM/L组的染毒效果和1.0μM/L染毒组相当;3. Cx43蛋白条带光密度定量分析结果显示:正常对照组、碱磷酶处理组或不同浓度乌头碱染毒组,心肌细胞中Cx43蛋白总量无显著差异;但乌头碱作用后,磷酸化的（P2 + P1） Cx43含量减少,而非磷酸化的NP Cx43含量增多。这提示,乌头碱虽不影响心肌细胞Cx43蛋白总量,但却能诱发其脱磷酸化,且呈一定的浓度依赖性。三、乌头碱对心肌细胞Cx43蛋白,羧基端肽段上特定位点磷酸化状态的影响1.本实验选择Cx43羧基端肽段,第368位丝氨酸残基（Ser368）的磷酸化状态作为研究对象。免疫荧光检测结果显示,在对照组中,标记P-Cx43 （Ser368）的绿色荧光信号分布于心肌细胞间交界处;而标记NP-Cx43 （Ser368）的红色荧光信号偶见于胞浆;2.染毒后,P-Cx43 （Ser368）信号明显减弱;而NP-Cx43 （Ser368）信号则显著增强,在心肌细胞间边界清晰可见。定量分析结果进一步说明,染毒后P-Cx43 （Ser368）信号减弱及NP-Cx43 （Ser368）信号增强,与对照组比较,均有显著性差异。实验证实,乌头碱能诱导Cx43蛋白羧基端第368位丝氨酸残基发生明显脱磷酸化。四、乌头碱对心肌细胞内[Ca2+]振荡的影响1.无论是否经乌头碱染毒,[Ca2+]在心肌细胞浆和细胞核中均表现为同步振荡;2.在对照组中,心肌细胞内[Ca2+]振荡不规则,但相对平稳,振荡幅度小,偶尔可见较明亮的Ca2+火花;3.乌头碱染毒后,Ca2+浓度在细胞浆和细胞核均出现剧烈振荡,典型的Ca2+火花闪烁现象消失,但细胞浆中Ca2+的平均浓度和对照组相比,并未显著升高。【结论】1.在实验选择的染毒浓度范围内（0.25 2.0μM/L）,不同剂量的乌头碱对培养心肌细胞的基本形态结构无明显的破坏作用;2.和正常对照组比较,不同浓度乌头碱染毒组,心肌细胞中Cx43蛋白总量未出现显著改变,说明乌头碱不影响Cx43蛋白总量的表达;3.随着乌头碱染毒浓度的提高,磷酸化的（P2 + P1） Cx43含量逐渐减少,而非磷酸化的NP Cx43含量逐渐增多,提示乌头碱可诱发心肌细胞中Cx43蛋白脱磷酸化,且呈一定的浓度依赖性;4.正常状态下,培养心肌细胞中Cx43蛋白羧基端肽段上,第368位丝氨酸残基（Ser368）处在磷酸化状态,乌头碱可诱导该位点发生明显脱磷酸化。由于Cx43蛋白的磷酸化状态对协调心肌细胞间电耦联关系密切,因此,诱导Cx43蛋白在特定位点脱磷酸化,是乌头碱对心肌细胞毒性作用的重要环节;5.乌头碱能作用于心肌细胞膜Na+通道,使Na+持续内流。理论上,胞内Na+浓度升高后,可通过Na+–Ca2+交换机制而导致胞内游离Ca2+浓度升高。但实验中我们发现,和对照组相比,乌头碱染毒后,胞浆中的平均Ca2+浓度并未显著升高,但细胞内Ca2+出现剧烈振荡。这提示,乌头碱染毒后,心肌细胞内并未发生Ca2+超载,但Ca2+浓度的剧烈振荡,很可能影响到心肌细胞内某些对[Ca2+]振荡频率敏感的信号转导过程。