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第一章巨噬细胞来源的Wnt促进肾纤维化的发生与发展研究背景Wnt/β-catenin信号通路在正常的器官发育中起着至关重要的作用,其异常的激活与慢性肾脏病肾纤维化密切相关。但是Wnt配体的细胞来源及其机制并未完全清楚。在损伤的肾脏中,来源于血液中单核/巨噬细胞和肾脏固有的巨噬细胞的持续激活与CKD病人肾纤维化的进展存在着密切的关联。然而,巨噬细胞来源的Wnt配体对巨噬细胞自身的增殖、迁移、极化以及其对肾纤维化的作用机会还需要被阐明。本研究旨在探讨巨噬细胞来源的Wnt对肾纤维化的促进作用。目的探讨巨噬细胞来源的Wnt在肾纤维化中的作用并研究其潜在的机制。方法构建UUO Od,3d,7d的动物模型,检测巨噬细胞的激活状态;分离小鼠骨髓来源的巨噬细胞,检测巨噬细胞分泌Wnt配体的水平。构建巨噬细胞特异性敲除Wntless的基因敲除鼠(Lyz-Wntless-/-),采用单侧输尿管梗阻(UUO)和单侧缺血再灌注及对侧肾切模型(UIRI),从而检测巨噬细胞Wntless基因的敲除对肾损伤引起的肾纤维化,Wnt/β-catenin信号通路的激活和下游靶基因以及炎症反应的影响。分离WT和KO小鼠骨髓来源的的巨噬细胞(BMDM),检测巨噬细胞Wntless基因的敲除对其迁移和极化的影响;分别使用WT和KO小鼠骨髓来源的的M1型巨噬细胞培养的细胞上清,刺激成纤维细胞,研究巨噬细胞来源的Wnt对成纤维细胞的作用;同时采用小分子ICG001来阻断Wnt/β-catenin信号通路,进一步研究巨噬细胞来源的Wnt对成纤维细胞的作用。结果在UUO Od,3d,7d的动物模型中,Western blot的结果显示M1型巨噬细胞的marker:B7-2和TNF-α处于持续的激活状态,M2型巨噬细胞的marker:MR在UU07d大量的表达,Arginasel在UU03d明显的升高,在UU07d有所降低。免疫荧光的结果显示MR在UUO7d的肾脏间质中广泛的表达。在UUO模型中,巨噬细胞条件性Wntless基因敲除的小鼠肾脏表达Fibronectin,α-SMA和胶原蛋白相比野生鼠明显降低;cKO小鼠Wnt/β-catenin信号通路受到明显抑制,其下游的靶蛋白PAI-1和Snail的表达也相应的降低;炎症反应相关蛋白如TNF-α和MCP-1的表达在cKO小鼠肾脏中显著降低,肾脏中巨噬细胞的浸润在cKO小鼠中也明显减少。在UIRI动物模型中,巨噬细胞Wntless基因敲除的小鼠肾脏表达Fibronectin,α-SMA,胶原蛋白和Vimentin相比野生鼠明显降低;cKO小鼠Wnt/β-catenin信号通路受到明显抑制,其下游的靶蛋白PAI-1和MMP-7的表达也相应的降低。在体外实验中,分离培养WT和cKO小鼠骨髓来源的巨噬细胞,进行划痕实验,cKO小鼠骨髓来源的巨噬细胞的迁移能力明显减弱;同时将WT和KO小鼠骨髓来源的巨噬细胞极化成M1和M2型,cKO小鼠骨髓来源的巨噬细胞表达M1和M2型巨噬细胞相应的标志物受到明显抑制。来源于cKO小鼠巨噬细胞上清能明显抑制成纤维细胞表达纤维化相关蛋白;同时小分子ICG001能阻断WT小鼠巨噬细胞上清对成纤维细胞的促增殖作用。结论通过敲除巨噬细胞Wntless基因,防止Wnt配体自巨噬细胞中分泌,能抑制肾损伤引起的肾纤维化、Wnt/β-catenin信号通路的激活以及炎症反应。Wntless基因的敲除能抑制巨噬细胞的迁移和极化。巨噬细胞来源的Wnt对成纤维细胞有促增殖作用。第二章 Klotho小分子肽-KP6减轻肾纤维化的机制及疗效的研究研究背景衰老是慢性肾脏病发生和发展的独立危险因素。Klotho是一个新颖的抗衰老蛋白,它在正常肾脏的小管细胞高度表达。膜型的Klotho作为FGF23的共受体,主要参与调节钙磷的代谢;Klotho作为内源性Wnt配体的抑制剂,可以和多种Wnt配体结合,阻断Wnt/β-catenin信号通路。外源的Klotho可以减轻多种因素引起的慢性肾脏病的肾损伤。但Klotho分子量大、结构复杂、制造成本昂贵、临床应用困难,目前尚未有Klotho的小分子肽段。目的鉴定和筛选有效的Klotho小分子片段,研究其作用的分子机制,体内给予Klotho小分子肽段,评价其在肾纤维化中的作用。方法人工合成18段Klotho小分子肽段。使用HKC-8细胞,转染Wntl质粒,同时分别孵育18段小分子肽段,使用Western blot的方法,检测各小分子肽段对Wntl表达所引起的细胞纤维化的影响。在HKC-8细胞上转染多种Wnt质粒,收集富含Wnt的条件培养基,来刺激成纤维细胞,同时孵育各小分子肽段,通过Western blot的方法检测各小分子肽段对富含Wnt条件培养基引起的成纤维细胞纤维化的影向。通过免疫共沉淀的实验方法检测各小分子肽段与Wnt以及Wnt/β-catenin信号通路中的组分的相互作用情况。使用活体器官成像的方法检测外源的小分子肽段能否作用于受损的肾脏。构建UUO和UIRI的慢性肾脏疾病的动物模型,从蛋白水平和基因表达水平检测小分子肽段对肾纤维化以及Wnt/β-catenin信号通路活性的影响。结果在HKC-8细胞上转染Wnt1质粒,同时孵育Klotho小分子肽段的实验结果显示,第6段小分子肽段,Klotho-derivedpeptide 6(KP6)能有效的抑制Wntl表达所引起的Fibronectin和α-SMA蛋白的上调。用富含Wnt的条件培养基刺激成纤维细胞,KP6也能有效的抑制Fibronectin和Vimentin蛋白的表达。免疫共沉淀的实验结果显示,KP6能与Wntl配体结合,并能竞争抑制Wntl与mKlotho以及Wnt配体的共受体LRP6的结合。小鼠器官成像的结果显示,KP6能靶向作用于受损肾脏。外源给予KP6能有效地减缓UUO和UIRI的慢性肾脏病进展,抑制肾脏纤维化和Wnt/β-catenin信号通路的激活。结论这些实验结果证实KP6作为Klotho来源的小分子肽段能特异性抑制Wnt/β-catenin信号通路。KP6通过阻断重要的促纤维化发生的信号通路,为慢性肾脏病提供了一个新颖而有效的治疗途径。