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第一部分GABAA受体类药物影响心肌梗死后左心室重塑和实验性临床事件的研究目的:探讨GABAA受体类药物对小鼠心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后心室重塑和实验性临床事件的影响方法:8～10周龄的C57BL/6小鼠经左前冠状动脉结扎后建立为MI模型,随机每天给予PBS缓冲液、GABAA受体激动剂(托吡酯)或GABAA受体阻断剂(荷包牡丹碱)腹腔注射至MI后14天。假手术组只穿线不结扎,余下的操作同模型组,术后每天腹腔给予PBS缓冲液。自MI后第1天起观察并记录小鼠的生存率,并通过对死亡小鼠的尸体解剖,确定其死亡原因;处死当天对小鼠行心脏超声和血流动力学检测其左心功能,并留取心脏标本通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)和Masson染色计算其梗死面积。单核/巨噬细胞去除的相关研究中,在MI模型建立前1天,模型建立后第3、6天给予氯磷酸盐脂质体,MI模型建立后依照分组(阴性对照组、普通心梗组、去除后给予PBS组、去除后给予托吡酯组、去除后给予荷包牡丹碱组)腹腔给予相应药物,并行生存率、心室破裂率,心脏超声、血流动力学,TTC、Masson染色计算梗死面积等检测。结果:MI模型建立后的第1天行心脏超声检测,验证模型建立成功且不因手术操作造成组间差异。心脏超声和血流动力学检测示:在MI后14天时,和MI后给予PBS组(Control组)相比,托吡酯给药组的左心功能明显改善,而荷包牡丹碱组的心功能恶化。TTC和Masson染色示:在MI后14天时,和Control组相比,托吡酯给药组的梗死面积减小,荷包牡丹碱组梗死面积增大;Masson染色进一步提示:在MI后14天时,和Control组相比,托吡酯给药组梗死区的胶原沉积增加,而非梗死区的纤维化无明显差异,荷包牡丹碱组梗死区的胶原沉积减少,非梗死区的纤维化亦无明显差异。实验性临床事件观察统计示:MI后28天内,和Control组相比,托吡酯给药组生存率提高、心室破裂率下降,而荷包牡丹碱组的结果与之相反。脂质体去除相关研究中,MI后7天,和MI后单纯去除单核/巨噬细胞组相比,MI后去除单核/巨噬细胞组并给予托吡酯组和去除单核/巨噬细胞组并给予荷包牡丹碱组的心功能、梗死面积、梗死区胶原沉积含量、生存率、心室破裂率均无明显差异。结论:GABAA受体类药物可影响MI后心脏功能、梗死面积、梗死区胶原沉积及生存率、心室破裂率。通过单核/巨噬细胞去除实验进一步表明,此作用机制可能是通过单核/巨噬细胞。第二部分GABAA受体类药物影响小鼠MI后单核/巨噬细胞极性的研究目的:探讨GABAA受体类药物对小鼠MI后单核/巨噬细胞极性的影响方法:首先,用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测托吡酯和荷包牡丹碱对应的GABAA受体亚基α1和β3在MI相关的免疫细胞上和心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞上是否表达。在体研究中,采用8～10周龄的C57BL/6小鼠经左前冠状动脉结扎后建立为MI模型,随机每天给予PBS、GABAA受体激动剂(托吡酯)或GABAA受体阻断剂(荷包牡丹碱)腹腔注射至处死当天。假手术组只穿线不结扎,余下的操作同模型组,术后每天腹腔给予PBS。于MI后1、3、7天,用流式细胞术检测骨髓、脾脏、外周血、心脏梗死局部Ly6Chigh型单核细胞和Ly6Clow型单核细胞的数量和比例,心脏梗死局部M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞和胚胎来源巨噬细胞(fetal derived macrophages,FDM)的数量和比例,外周血、心脏梗死局部中性粒细胞数量,脾脏Th1和Th2细胞的数量。于MI后1、3、7天,用酶联免疫法检测外周血中IL-1β的水平;于MI后1、3、7天,用荧光定量PCR法检测骨髓、脾脏、心脏梗死局部IL-1β的表达。离体实验中,小鼠巨噬细胞系(RAW246.7)分为M1型巨噬细胞相关的空白对照组,IFN-γ刺激组(Control组),IFN-γ+托吡酯给药组,IFN-γ+荷包牡丹碱给药组;M2型巨噬细胞相关的空白对照组,IL-4刺激组(Control组),IL-4+托吡酯给药组,IL-4+荷包牡丹碱给药组。干预结束后,免疫荧光法观察各组细胞中M1型或M2型巨噬细胞所占的比例;流式检测法计算各组细胞中M1型或M2型巨噬细胞所占的比例。结果:GABAA受体的β3亚基在巨噬细胞和中性粒细胞上有表达,但在单核细胞、Th1、Th2上不表达,且在心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞上不表达;GABAA受体的α1亚基在单核细胞、巨噬细胞、Th1、Th2和中性粒细胞上有表达,但在心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞上不表达。在体研究中,流式细胞术示:MI后3、7天,和MI后给予PBS组(Control组)相比,托吡酯给药组的脾脏、外周血、心脏梗死局部Ly6Chigh型单核细胞数量和比例减少、Ly6Clow型单核细胞数量和比例增加,心脏梗死局部M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞或数量和比例减少、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞的数量和比例增加、FDM、Th2细胞数量增加,而荷包牡丹碱组的结果与之相反;流式细胞术示:MI后1、3、7天,和Control组相比,托吡酯组和荷包牡丹碱组的骨髓Ly6Chigh型和Ly6Clow型单核细胞数量和比例无明显变化,外周血、心脏梗死局部中性粒细胞数量无明显变化,脾脏Thl数量无明显变化。免疫组化法和流式细胞术示:MI后1、3、7天,和Control组相比,托吡酯组和荷包牡丹碱组心脏梗死局部巨噬细胞总数无明显差异。酶联免疫法示:MI后3、7天,和Control组相比,托吡酯组外周血中IL-1β的水平降低,荷包牡丹碱组的结果与之相反;荧光定量PCR法示:MI后3、7天,和Control组相比,托吡酯组骨髓、脾脏、心脏梗死局部IL-1β的表达降低,荷包牡丹碱组的结果与之相反。离体试验中,免疫荧光法示:和IFN-γ刺激组相比,IFN-γ+托吡酯给药组和IFN-γ+荷包牡丹碱给药组均对M1型巨噬细胞数量无明显改变;和IL-4刺激组相比,IL-4+托吡酯给药组和IL-4+荷包牡丹碱给药组均对M2型巨噬细胞数量无明显改变。流式细胞术示:和IFN-y刺激组相比,IFN-γ+托吡酯给药组和IFN-γ+荷包牡丹碱给药组均对M1型巨噬细胞所占比例无明显改变;和IL-4刺激组相比,IL-4+托吡酯给药组和IL-4+荷包牡丹碱给药组均对M2型巨噬细胞所占比例无明显改变。结论:托吡酯可通过GABAA受体的β3亚基直接作用于巨噬细胞,同时,通过降低骨髓、脾脏、外周血、心脏梗死局部的IL-1β的表达和水平减少外周Ly6Chigh型单核细胞的数量。荷包牡丹碱可通过GABAA受体的α1亚基直接作用干单核细胞、巨噬细胞。在体条件下,GABAA受体类药物可影响MI后Ly6Chigh/LyClow型单核细胞、M1/M2型巨噬细胞、Ly6Chigh/Ly6Clow型巨噬细胞、Th1/Th2的极化,其中,托吡酯可减少促炎性细胞Ly6Chigh型单核细胞、M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞的数量,增加抑炎性Ly6Clow型单核细胞、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞、FDM、Th2的数量。离体条件下,托吡酯和荷包牡丹碱均不能直接影响巨噬细胞的极性变化。单核/巨噬细胞去除实验表明,GABAA受体类药物调节炎症反应是主要通过作用于单核/巨噬细胞。第三部分GABAA受体类药物调节巨噬细胞活性影响心肌梗死后损伤/修复平衡机制的研究目的:探讨GABAA受体类药物作用于巨噬细胞对小鼠MI后损伤/修复平衡的影响方法:于MI后1、3、7、14天,用实时荧光定量PCR法、免疫印迹法或明胶酶谱法检测心脏梗死局部M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞相关的促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-9和M2型或Ly6Clow型巨噬细胞相关的抑炎性细胞因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表达;于MI后7、14天,用免疫荧光检测心肌组织中血管新生和肌成纤维细胞分化水平;于MI后7、14天,用免疫组化和苦味酸天狼星红染色法检测心肌组织中I型胶原的含量。结果:实时荧光定量PCR法、免疫印迹法或明胶酶谱法示:MI后3、7、14天,和Control组相比,托吡酯组心脏梗死局部的M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-9的表达或活性降低、M2型或Ly6Clow型巨噬细胞相关细胞因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表达升高,荷包牡丹碱组与之相反;免疫荧光法示:MI后7、14天,和Control组相比,托吡酯组心肌组织中血管新生和肌成纤维细胞分化水平均升高,荷包牡丹碱组与之相反;免疫组化和苦味酸天狼星红染色法示:MI后7、14天,和Control组相比,托吡酯组心肌组织中Ⅰ型胶原的含量增多,荷包牡丹碱组与之相反。结论:托吡酯通过减少M1型或Ly6Chigh型巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、IL-6、MMP-9的表达或活性,升高M2型或Ly6Clow型巨噬细胞相关细胞因子IL-10、VEGF、TGF-β1的表达,从而减轻炎症反应、细胞外基质降解,增多血管新生、肌成纤维细胞分化、梗死区Ⅰ型胶原沉积,最终减轻MI后炎症反应对心脏组织的损伤,增强心肌瘢痕修复。