论文部分内容阅读
目的：糖尿病周围神经病变是糖尿病常见的慢性并发症，严重影响患者生活质量，临床缺乏有效的治疗方法。因此，研究疗效可靠的中药或有效成分具有重要的临床应用意义。现代药理研究表明：黄连及其生物碱成分(小檗碱)对于改善糖尿病及其并发症具有明显效果。因此，本实验建立2型糖尿病大鼠模型，探讨黄连生物碱预防给药对糖尿病周围神经病变和糖尿病肌病的保护作用及其可能的机制。
方法：
1．建立高效液相色谱法测定黄连中生物碱含量的方法；
2．以小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱和药根碱的总提取率作为筛选指标，通过正交实验筛选黄连主要活性成分的最佳提取工艺；
3．采用腹腔注射小剂量链脲佐菌素和高热量饲料喂养诱导2型糖尿病大鼠模型，设立黄连生物碱低、中、高剂量组，以等剂量小檗碱原料药为对照；观察黄连生物碱对其体重、糖代谢、脂代谢，坐骨神经感觉和运动传导功能，血液流变学改变，光镜及电镜下超微结构的影响；并主要从糖尿病引起的代谢障碍角度，探讨了黄连生物碱对糖尿病大鼠多元醇代谢通路，氧自由基损伤以及神经营养因子变化的影响；
4．观察黄连生物碱对糖尿病大鼠骨骼肌糖原储备，抗氧自由基损伤能力，复合肌肉动作电位，骨骼肌病理形态改变，运动终板形态和数量的影响。应用PCR和免疫印迹技术观察黄连生物碱对骨骼肌胰岛素信号转导通路受体后水平的影响。
结果：
1．采用离子对高效液相色谱法，在流动相为乙腈：0.05mol·L<-1>磷酸二氢钾(40：60，内含0.015mol·L<-1>十二烷基磺酸钠)，检测波长345nm，柱温37℃，流速1.2ml/min的色谱条件下，可同时分离和测定黄连中5种生物碱的含量，其含量由高到低的顺序为小檗碱>黄连碱>巴马汀≥表小檗碱>药根碱，它们之间的含量比例约为7．7：2．5：2．2：2．1：1。
2．采用8ml/g的液料比，50％乙醇回流提取4次，每次提取120min的条件提取并减压浓缩得到黄连生物碱浸膏。浸膏中生物碱的含量分别为16.04+0.12％(15g生药)和15.97±0.20％(150g生药)。经高效液相色谱法定量，黄连浸膏和黄连生物碱制品的纯度分别为63.49±1.37％和95.64±2.20％。经薄层色谱定性，黄连浸膏及黄连生物碱制品各成分的斑点位置与对照品色谱相对应。
3.黄连生物碱对糖尿病周围神经的保护作用
①黄连生物碱对STZ糖尿病大鼠的体重无明显性影响，但可降低糖尿病大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白比值、降低血清总胆固醇和甘油三酯水平，提高糖尿病大鼠血清胰岛素水平。
②神经传导：模型组的MNCV和SNCV均较空白组减慢(P<0.05)。黄连生物碱可抑制坐骨神经传导速度的减慢，AM组SNCV较模型组明显提高(P<0.05)，AH组MNCV和SNCV较模型组明显提高(P<0.05)。
③血液流变学：黄连生物碱可降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞聚集指数，缩短红细胞电泳时间。AM组和AH组大鼠的全血粘度(高切200/S、中切30/S、低切3/S)、血浆粘度和红细胞电泳时间较BM组和BH组有显著性差异(P<0.05)。AH组的红细胞聚集指数较BH组有显著性差异(P<0.05)。
④黄连生物碱可不同程度地减轻坐骨神经的病理改变：降低糖尿病大鼠坐骨神经发生溃变的比例，增加有髓鞘神经纤维密度，减少有髓神经纤维平均截面积。AH组未见明显的髓鞘分离，疗效优于AM组和AL组。AH组大鼠坐骨神经发生溃变的比例明显低于模型组(P<0.05)，AH组有髓神经纤维截面积明显少于模型组(P<0.05)。
⑤氧自由基代谢： AM组、AH组血浆CArr活性较模型组明显升高(P<0.05)；AH组坐骨神经中CAT活性较模型组升高(P<0.05)。AH组的血浆和坐骨神经中SOD活性较模型组明显升高(P<0.05)。AH组血浆GSH-PX活性较模型组升高(P<0.05)。AM组、AH组血浆和坐骨神经。MDA含量较模型组降低(P<0.05)。
⑥多元醇代谢通路：黄连生物碱预防给药后，AM组、AH组大鼠的红细胞醛糖还原酶活性和坐骨神经ARmRNA的表达较模型组明显降低(P<0.05)。
⑦坐骨神经营养因子：黄连生物碱预防给药后，AM组、AH组大鼠坐骨神经IGF-1mRNA的表达较模型组明显升高(P<0.05)，AH组坐骨神经IGF-1mRNA表达较BH组有显著性差异(P<0.05)。
4.黄连生物碱对糖尿病肌病的保护作用
①黄连生物碱中剂量和高剂量可明显升高大鼠肌糖原水平，其中AH组大鼠肌糖原水平较模型组明显升高(P<0.05)。
②自由基：黄连生物碱可升高骨骼肌CAT、GSH-PX活性，降低SOD活性和MDA含量，其中AM组、AH组骨骼肌CAT、GSH-PX活性升高，SOD活性和MDA含量明显降低，较模型组有显著性差异(P<0.05)。
③复合肌肉动作电位：黄连生物碱预防给药组大鼠复合肌肉动作电位的潜伏期缩短，动作电位的传导速度加快。AM组、AH组传导速度明显快于模型组(P<0.05)。
④IRS-1：黄连生物碱对IRS-1mRNA和IRS-1蛋白表达有不同程度的上调作用。AM组和AH组与模型组相比，有显著性差异(P<0.05)，高剂量的上调最强。其中AH组骨骼肌IRS-1蛋白表达较BH组有显著性差异(P<0.05)。
⑤Akt：黄连生物碱对AktlmRNA表达有轻微的上调作用，但与模型组比较无显著差异(P>0.05)。AH组骨骼肌Akt2mRNA表达较模型组明显升高(P<0.05)。骨骼肌中p-Akt蛋白表达增加，与模型组无显著性差异(P>0.05)。
⑥Glut4:黄连生物碱预防给药组大鼠骨骼肌Glut4mRNA和Glut4膜蛋白的表达增加。AM组和AH组骨骼肌Glut4mRNA和Glut4膜蛋白的表达较模型组明显增加(P<0.05)。
⑦p38MAPK：黄连生物碱明显升高骨骼肌p38MAPK蛋白的表达，较模型组有显著性差异(P<0.05)。AM组和AH组大鼠骨骼肌p38MAPK蛋白表达高于BM组和BH组(P<0.05)。
结论：
1.该色谱条件可同时分离和测定黄连中5种生物碱的含量，方法灵敏、定量准确。
2.采用该工艺回流提取，黄连有效成分的提取率较高，提取工艺稳定。
3.黄连生物碱通过降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白比值和血清甘油三脂和胆固醇水平，提高糖尿病大鼠血浆胰岛素水平。
4.提高坐骨神经感觉和运动传导速度，缩短动作电位潜伏期；调节自由基代谢紊乱，减轻脂质过氧化反应；抑制多元醇代谢通路中AR活性和改善血液高粘状态；增加坐骨神经营养因子的表达而改善糖尿病大鼠周围神经功能和结构，提示黄连生物碱对糖尿病周围神经病变具有保护作用。
5.黄连生物碱预防给药可提高骨骼肌糖原储存；加快复合肌肉动作电位的传导速度；有效增加糖尿病大鼠骨骼肌中IRS-1、Glut4mRNA和蛋白的表达以及p38MAPK蛋白表达，其作用可能与提高外周组织对胰岛素的敏感性和通过影响骨骼肌p38MAPK通路从而调节体内的葡萄糖代谢有关。
6.小檗碱是黄连生物碱防治糖尿病神经肌肉损伤的主要成分。