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目的苦参为豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait)的干燥根,始载于《神农本草经》,多生于沙地或山坡草地,全国各地均有分布。近年来,随着苦参野生资源大量减少,人工栽培品逐渐成为临床用药的主要来源。现代药理研究发现苦参中的生物碱成分具有较好的抗癌活性,其中槐定碱(Sophoridine)已经由我国自主研发其制剂“槐定碱注射液”。近年来有报道显示槐定碱有抑制结直肠癌的活性,然而具体作用机制尚不明确。本研究对苦参进行生药学鉴定的调查,并深入挖掘苦参的主要成分——槐定碱抗结直肠癌的潜在靶点及具体机制,以期为苦参的资源利用、槐定碱的临床用药及抗结直肠癌药物的研发提供参考。方法苦参的生药学鉴定:结合中国植物志、中国数字植物标本馆、第四次全国中药普查和文献分析,对苦参的生药学特征以及资源分布进行调查。槐定碱抗结直肠癌分子作用研究:1.利用HCT116、SW480和RKO结直肠癌细胞模型,通过平板克隆形成实验检测不同浓度的槐定碱对细胞克隆能力的影响,使用CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒)检测不同浓度的槐定碱对细胞增殖率的影响。2.利用不同浓度槐定碱处理结直肠癌SW480和RKO细胞,通过Western Blot(蛋白免疫印迹实验)检测细胞凋亡标志蛋白Bcl-2(B-Cell CLL/Lymphoma 2,抑凋亡相关因子)和Bax(Bcl-2 Associated X Protein,促凋亡相关因子)的表达水平,利用流式细胞术检测细胞凋亡比率,观察槐定碱对结直肠癌细胞凋亡的影响。3.利用蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验(Immunofluorescence s Staining,IF),检测不同浓度槐定碱处理后细胞自噬标志蛋白LC-3(Microtubule Associated Protein 1 Light Chain 3,微管相关蛋白)和p62(Sequestosome 1,泛素结合蛋白)表达水平的变化,观察槐定碱对结直肠癌细胞自噬的影响。4.利用不同浓度槐定碱处理结直肠癌SW480和RKO细胞,通过蛋白免疫印迹实验检测细胞周期相关蛋白p27(Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1B,细胞周期抑制蛋白)和Cyclin D1(Cyclin D1 Protein,G1/S-特异性周期蛋白-D1)的表达水平,通过流式细胞术检测细胞各周期的细胞比例,观察槐定碱对结直肠癌细胞周期的影响。槐定碱抗结直肠癌潜在靶点研究:1.利用网络药理学的方法预测槐定碱在结直肠癌中的潜在靶点。通过pharm Mapper数据库预测槐定碱的潜在靶标,获得靶标集。从dis Ge NET数据库获得结直肠癌相关基因,与靶标集进行映射,并利用Cytoscape软件构建药物靶标网络(Drug-Target Network,D-T)。String数据库可获得蛋白互作列表,构建蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction Network,PPI)。生物学功能及通路富集由Cytoscape软件的ClueGO插件构建。2.细胞热转变分析实验(Cell Thermal Transformation Analysis,CETSA)和药物亲和力反应测定实验(Drug Affinity Response Target Stability,DARTS)检测槐定碱与MAPKAPK2(MAP Kinase-Activated Protein Kinase-2,MAP激酶活化蛋白激酶2)的结合能力。利用分子对接模拟槐定碱与MAPKAPK2的结合模式。槐定碱通过作用于潜在靶点抗结直肠癌机制研究:1.利用转染MAPKAPK2质粒的方法,使结直肠癌SW480和RKO细胞中的MAPKAPK2蛋白异位表达。通过蛋白印迹实验检测MAPKAPK2的表达情况。MAPKAPK2过表达后,通过平板克隆形成实验、CCK-8检测实验、蛋白免疫印迹实验、免疫荧光实验及流式细胞术实验,检测过表达MAPKAPK2对槐定碱调节结直肠癌细胞增殖、凋亡、自噬和周期的影响。2.采用si RNA(Small Interfering RNA,小干扰RNA)沉默结直肠癌SW480和RKO细胞的内源性MAPKAPK2后,应用平板克隆形成实验、CCK-8检测实验、蛋白免疫印迹实验、免疫荧光实验及流式细胞术实验,检测沉默MAPKAPK2对槐定碱调节结直肠癌细胞增殖、凋亡、自噬和周期的影响。3.利用GEO数据库中结直肠癌病人的基因表达谱,分析MAPKAPK2与临床病人的生存率及结直肠癌发生的相关性。利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)分析MAPKAPK2与结直肠癌细胞的生物过程的相关性。结果苦参的生药学鉴定:总结了苦参性状鉴定的标准,统计了我国苦参野生资源大面积分布地及大规模人工培育基地分布地,揭示了适宜苦参生长的地域环境。槐定碱抗结直肠癌分子作用研究:1.平板克隆形成实验结果显示,槐定碱明显抑制细胞克隆能力;CCK-8检测表明,槐定碱呈剂量依赖性抑制结直肠癌细胞的增殖率。2.蛋白免疫印迹实验结果表明,槐定碱显著下调Bcl-2和上调Bax的表达水平;流式细胞术结果表明,槐定碱明显诱导结直肠癌细胞凋亡。3.蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验结果表明,槐定碱显著下调p62和上调LC-3的表达水平,促进结直肠癌细胞自噬。3.蛋白免疫印迹实验结果表明,槐定碱显著上调p27和下调Cyclin D1的表达水平,流式细胞术检测结果显示,槐定碱能显著提高G0/G1期的细胞数,同时降低G2/M期的细胞数,对结直肠癌细胞周期有一定的阻滞作用。槐定碱抗结直肠癌潜在靶点研究:1.通过网络药理学的方法预测,结合通路富集分析,发现MAPK信号通路在槐定碱调节结直肠癌的过程中至关重要,MAPKAPK2可能是槐定碱在结直肠癌中的潜在靶点。2.细胞热转变分析实验和药物亲和力反应测定实验显示槐定碱能与MAPKAPK2蛋白直接结合。分子对接模拟结果显示了槐定碱与MAPKAPK2的最佳结合模式,槐定碱能够特异性结合在MAPKAPK2的ATP口袋中;蛋白免疫印迹实验检测了槐定碱抑制MAPKAPK2的Thr222位点磷酸化。槐定碱通过作用于潜在靶点抗结直肠癌机制研究:1.在结直肠癌SW480和RKO细胞中异位表达MAPKAPK2蛋白后,平板克隆形成实验、CCK-8检测实验、蛋白免疫印迹实验、免疫荧光实验及流式细胞术实验结果显示,MAPKAPK2能显著恢复槐定碱调节的结直肠癌细胞增殖、凋亡、自噬和周期。2.利用si MAPKAPK2沉默结直肠癌SW480和RKO细胞的内源性MAPKAPK2后,平板克隆形成实验、CCK-8检测实验、蛋白免疫印迹实验、免疫荧光实验及流式细胞术实验结果显示,si MAPKAPK2对结直肠癌细胞增殖、凋亡、自噬和周期的调节与槐定碱的效果相似,且能够加强槐定碱的调节作用。3.结直肠癌病人生存信息分析结果显示,MAPKAPK2转录水平较高时,病人的生存期明显缩短,而MAPKAPK2转录水平较低时,病人的生存期明显延长,且在结直肠癌病人组织中MAPKAPK2转录水平比正常组织明显上调。GSEA结果显示MAPKAPK2与促进细胞增殖、细胞周期相关基因相关,与抑制细胞凋亡、细胞自噬相关基因相关。结论本研究总结了苦参性状鉴定的标准,统计了我国苦参野生资源大面积分布范围及大规模人工培育基地分布地,为苦参资源的开发利用提供了参考。利用分子生物学实验及网络药理学手段揭示了苦参中的主要抗癌活性成分之一——槐定碱抗结直肠癌的作用靶点为MAPKAPK2。槐定碱通过靶向结合抑制MAPKAPK2,调节结直肠癌细胞的增殖、凋亡、自噬及细胞周期,进而抑制结直肠癌的发生与发展。