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目的： 通过在体外分阶段的序贯诱导途径，探索小鼠胚胎干细胞(ES)及诱导型多潜能干细胞(iPS)向角膜内皮样细胞定向分化的潜能，探究化学分子RA，细胞因子(bFGF、BMP4)联合体细胞共培养诱导的具体条件和方案，以期阐明其定向分化中的关键机制，并验证ES和iPS细胞作为角膜组织工程种子细胞的可行性，为组织工程角膜内皮层重建寻找来源充足，安全可靠的新型种子细胞奠定基础。 方法： 1.体外撕膜法分离消化新西兰大白兔的角膜内皮细胞及晶状体上皮细胞，建立培养扩增体系，并对其活力和特异性表达的标志物进行免疫荧光细胞化学（ICC）鉴定。收集晶状体上皮细胞的条件培养液，采用MTT法、Ki67的免疫荧光检测角膜内皮细胞在条件培养液中的增殖能力，用Western blot评估其表型标记物表达的变化。 2.应用mef制备feeder，联合ES培养液维持和扩增小鼠ES细胞及iPS细胞系，并鉴定其全能性指标。去除lif因子及feeder，在低黏附培养皿中悬浮培养拟胚体EB，EB形成第四天加入不同浓度RA,并在不同时间点用定量PCR检测神经脊分化的指标。选择和比较不同的细胞外基质包括纤维连接蛋白、层粘蛋白、明胶、多聚赖氨酸和组织液房水作培养板的包被对神经脊（neural crest,NC）细胞迁出分化的影响，并采用ICC法对分化标志物进行检测。 3.用P2-P3的兔角膜内皮细胞和兔晶状体上皮细胞分别进行如下共培养处理，包括：①条件培养液收集；②微胶囊包裹隔离共培养；③作为transwell小室隔离共培养的细胞；④丝裂霉素C处理制备饲细胞铺层；⑤活性细胞铺层。将初步诱导的NC样细胞序贯进入共培养阶段，比较并确定合适的共培养方法。应用ICC对分化后内皮样细胞进行表面标记关键分子的鉴定，定量PCR对分化后细胞mRNA表达谱的分析。 4.采用bFGF+BMP4单层贴壁法诱导ES细胞向神经脊干细胞分化，后续条件培养液诱导向角膜内皮样细胞分化，并用ICC鉴定分化标记物的表达情况，用定量PCR分析基因表达的变化。 结果： 1.兔角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞在体外可以稳定地培养增殖，并表达其组织特异性的标记物。晶状体的条件培养液对角膜内皮细胞的增殖没有明显影响，但能上调角膜内皮细胞中ZO-1，N-cadherin和Vimentin的表达。 2.ES/iPS细胞在lif和feeder的培养条件下表达全能性的标记物Oct4，SSEA-1，AP(+)；去除lif和feeder后，在悬浮培养过程中形成拟胚体EB，第四天添加RA继续培养，随后的第四天获得一组神经脊分化标记物最高的表达。EB重新贴壁后继续培养时有大量细胞迁出，ICC检测显示有Nestin，P75，AP-2α，SOX10等的表达。 3.Transwell小室，微胶囊包裹的实验组，EB细胞迁出生长，但不能维持良好的长势；在活性细胞做铺层的接触共培养组，EB细胞迁出受阻，出现大量的细胞凋亡；在晶状体上皮细胞及角膜内皮细胞条件培养液诱导7-8天后，诱导细胞形成紧密的铺路石结构，表达AQP1，ZO-1，Na+-K+-ATPase，N-cadherin等内皮标记。在长时间明胶铺层及Fn、Ln、多聚赖氨酸和兔房水铺层中，长时间明胶铺层能较好地维持EB贴壁生长并促进向内皮样细胞的分化。 4.在单层细胞贴壁分化中，bFGF+BMP4诱导ES-cells表达神经脊细胞的标记物，继续晶状体条件培养液诱导6d出现角膜内皮样细胞标记物的表达。 结论： 1通过撕膜法可以建立稳定的兔角膜内皮细胞和晶状体上皮细胞的培养体系。晶状体上皮细胞条件培养液能更好地维持角膜内皮细胞的表型包括中ZO-1、N-cadherin、Vimentin，对细胞增殖没有明显影响。 2.小鼠ES/iPS细胞可以通过EB途径经RA诱导向神经脊多潜能间充质干细胞分化。在定向分化中，长时间的明胶铺层效果更优于Laminin和Fibronectin所做的铺层。 3.条件培养液是一种简单、可行、可控的共培养模式。在序贯法诱导方案中，角膜内皮细胞条件培养液和晶状体上皮细胞的条件培养液均能有效促进ES/iPS细胞来源的神经脊间充质干细胞向角膜内皮细胞的分化。 4.单层细胞贴壁分化联合bFGF+BMP4因子诱导ES细胞向神经脊多潜能间充干细胞分化，后续应用晶状体上皮细胞条件培养液能更高效地诱导ES细胞分化成角膜内皮样细胞。