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菊粉酶是一类是能水解13-2,1-D-果聚糖果糖苷键的水解酶,属于GH32糖苷水解酶家族,菊粉酶在微生物和植物中广泛存在。上个世纪20年代,科学家发现某些微生物能发酵菊芋,1991年成功利用分子生物学方法克隆得到菊粉酶基因。此后菊粉酶的功能、性质、结构引起了研究人员的兴趣。但是至今研究还未完全揭示菊粉酶蛋白所有性质和结构特征。菊粉酶根据水解菊粉方式不同,分为内切菊粉酶和外切菊粉酶,它们分别水解菊粉得到的低聚果糖和果糖,两种产品在工业生产中都有应用。利用基因工程手段将菊粉酶基因在毕赤酵母中表达并高密度发酵生产得到高浓度的菊粉酶蛋白是生产低聚果糖和果糖的有效方法,能降低成本,提高利用率。本论文首先通过引物设计从马科斯克鲁维酵母染色体上克隆得到包括INU1基因ORF在内的菊粉酶基因大片段,再以大片段基因为模板扩增INU1基因的ORF。利用‘TA’克隆将INU1片段与pEASY T3载体连接,构建了在大肠杆菌中复制的pEASY T3-INU1重组载体。利用限制性内切酶切重组T3-INU1载体和pPIC9载体,得到有相同粘性末端的INU1片段和线性的pPIC9,利用连接酶将两片段连接,构建了能在大肠杆菌和毕赤酵母中复制表达的穿梭质粒pPIC9-INU1。论文第二部分是将线性化的pPIC9-INU1载体通过电转化的方法转移至毕赤酵母中,利用载体5’AOX基因与毕赤酵母染色体上5’AOX基因的同源性,将其同源重组。重组转化子含有HTS4基因,能在无组氨酸的培养基中生长,利用组氨酸营养缺陷型筛选毕赤酵母重组转化子。PCR验证阳性转化子。实验利用甲醇作为唯一碳源和诱导剂,诱导转化子表达重组菊粉酶蛋白。浓缩发酵液上清中的蛋白,利用SDS-PAGE电泳检测发酵液中蛋白表达情况,实验结果显示,转化子能大量表达重组酶蛋白,并利用载体自身的信号肽将蛋白分泌到细胞外。利用DNS方法检测重组酶活性,摇瓶发酵转化子产酶量不断提高,在163h时酶活性达到峰值,达到10.168U,将4号转化子接种到5L发酵罐中培养,酶活达到12.458U／ml。菌体OD600达到39.48,比马科斯克鲁维酵母酶活性(4.874U)提高近3倍左右。本实验从基因工程手段和重组蛋白表达两方面研究菊粉酶基因INU1在毕赤酵母中的表达。并研究了工程菌在产酶方面的能力和优势,为转化子表达重组蛋白应用于工业化生产提供依据。