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目的（1）改良二袖套法大鼠原位肝脏移植动物模型的成功建立。（2）改良二袖套法大鼠原位肝脏移植急性排斥动物模型的建立。（3）重组腺病毒pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-OX40Ig（AdOX40Ig）的构建（4）研究重组腺病毒AdOX40Ig不同感染剂量对人肝细胞HL-7702生长的影响及其感染效率,筛选最佳感染剂量进行该重组腺病毒的生物学功能研究。（5）探讨腺病毒介导OX40Ig基因转移在诱导大鼠肝脏移植物长期存活中的作用和机制。方法（1）通过改良的双袖套法对130对SD大鼠进行了原位肝移植。前面40对为预试验组,中间60对为实验熟练组,后面30对为实验完善组。观察各组的手术成功率和术后生存率以及手术并发症。（2）采用改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway（BN）大鼠原位肝脏移植共30例,将其随机分成实验组15例,术后未进行特殊的干预,和对照组15例,术后1～7天用FK506 0.2mg/（kg.d）灌胃。术后4、7和10天的时间点上各组均随机处死3只受体大鼠,收集血清与肝脏标本,其余受体大鼠的血清标本通过舌静脉取血获得。血清标本检测细胞因子和生化指标,肝脏标本观察病理变化和肝细胞凋亡。每组各留6只观察术后生存情况及生存时间。（3）将经过双酶切的hOX40片段和hIgG1 Fc片段与同样经过双酶切的pAdTrack-CMV载体进行连接反应,并在大肠杆菌感受态细胞里转化成pAdTrack-CMV-hOX40Ig转移质粒,再通过PCR扩增双酶切及DNA测序鉴定,经鉴定正确的质粒命名为pAdTrack-CMV-OX40Ig（pTOX40Ig）。将pTOX40Ig转移质粒经PmeⅠ单酶切线性化后,与pAdeasy-1腺病毒载体氯化钙法共转化BJ5183感受态细胞,涂布卡那平板,挑选克隆、扩增,抽提质粒行PCR及PacⅠ酶切鉴定。鉴定正确的重组腺病毒质粒pAdOX40Ig经PacⅠ酶切后,采用Lipofectamine2000脂质体转染法转染293A细胞,转染第3天在荧光显微镜下观察荧光。重组腺病毒AdOX40Ig通过Western印迹鉴定。（4）将AdvOX40Ig重组腺病毒以1、10、25、50、100、200MOI不同剂量感染HL-7702细胞。在普通光镜视野下观察被感染后HL-7702细胞形态,在荧光视野下观察绿色荧光。将AdvOX40Ig重组腺病毒和Ad空载体腺病毒以50MOI剂量分别感染爬片的HL-7702细胞,用免疫荧光染色试剂盒进行间接免疫荧光检测腺病毒介导的外源性OX40Ig基因在HL-7702细胞中的表达;用ELISA法测定转染AdvOX40Ig的HL-7702肝细胞培养上清。（5）改良二袖套法行Lewis大鼠到Brown Norway（BN）大鼠原位肝脏移植40例,随机分成4组,每组10对。对照组:供、受体均未经任何处理,空载病毒AdEGFP处理组:术中供肝离体后肝内留存2ml的AdEGFP腺病毒[1×109pfu/ml],AdOX40Ig处理组:术中供肝离体后肝内留存2ml的AdOX40Ig腺病毒[1×109pfu/ml],FK506处理组:术后FK506(0.2mg·kg-1·d-1)灌胃。术后第7天每组各处死BN鼠3只,先经下腔静脉抽血,取部分血清,进行肝功能的检测,取肝脏,观察病理变化和肝细胞凋亡,取脾脏细胞与Lewis大鼠和第三品系F344大鼠的脾脏细胞进行单向混合淋巴细胞反应（MLR）。在BN大鼠与Lewis大鼠的MLR反应体系中,另取3个复孔,在每个复孔中加入20μl（1 IU/μl）重组IL2。取四组处死BN大鼠的剩余血清及术前舌静脉采血取得的血清,采用双抗体夹心ABC-ELISA法来检测IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量。余大鼠观察生存期,并且分别于病毒给予当天和第1、3、7、10、14、21和28天取大鼠尾静脉血,收集血清。用ELISA法检测血清中OX40Ig蛋白表达水平。结果（1）预试验组的手术成功率和7天生存率分别为27.5%和0;实验熟练组分别为75.0%和40.0%;实验完善组分别为93.3%和86.7%。（2）手术的成功率是93.7%（30/32）。实验组大鼠在术后7～10天表现出明显的急性排斥症状。实验组的生存时间是9.17±1.17（天）,而对照组是50.17±8.50（天）。实验组的肝功能（AST、ALT、TB）明显高于对照组。实验组术后第7天的血清IFN-γ和IL-2浓度明显高于术前,而IL-4和IL-10浓度则明显低于术前;对照组正好与此相反,术后第7天的血清IFN-γ和IL-2浓度明显低于术前,而IL-4和IL-10浓度明显高于术前。受体大鼠术后肝脏病理组织学检查发现,实验组术后第7天出现中度细胞性排斥,10天出现重度细胞性排斥,而对照组术后第7和第10天呈轻微细胞性排斥。此外,实验组肝细胞凋亡数较对照组显著增多。（3）经酶切反应及DNA测序鉴定,重组腺病毒质粒pAdOX40Ig序列正确。重组腺病毒质粒pAdOX40Ig转染293A细胞,转染第3天在荧光显微镜下能观察到荧光。反复冻融的重组病毒子经多轮感染后,检测效价达到1010pfu/ml。重组腺病毒AdOX40Ig的Western印迹鉴定可以看到48.7kD的条带。（4）在普通光镜视野下观察1、10、25、50、100MOI不同剂量重组腺病毒感染组HL-7702细胞均形态正常,生长良好;而200MOI剂量感染组细胞圆缩、脱落,呈现明显的细胞毒性;在荧光视野下,10、25、50、100、200MOI不同剂量重组腺病毒感染组HL-7702细胞几乎所有细胞均可观察到绿色荧光。AdvOX40Ig感染组HL-7702细胞能检测到Cy3红色荧光,而Ad空病毒感染组和未感染组HL-7702细胞则未出现红色荧光。ELISA测定显示,AdOX40Ig感染组细胞培养上清中OX40Ig浓度明显高于无病毒感染组和AdEGFP感染组。（5）AdOX40Ig处理组和FK506处理组受体大鼠存活时间明显超过对照组和空载病毒AdEGFP处理组,肝功能（AST、ALT、TB）明显低于对照组和空载病毒AdEGFP处理组,肝细胞性排斥明显低于对照组和空载病毒AdEGFP处理组,肝细胞凋亡也明显少于对照组和空载病毒AdEGFP处理组。术后AdOX40Ig处理组和FK506处理组受体大鼠血清中IFN-γ、IL-2的含量较术前明显降低（P＜0.05）,而IL-4和IL-10的含量则较术前明显升高（P＜0.05）;对照组和空载病毒AdEGFP处理组大鼠肝移植术后排斥组血清中IFN-γ、IL-2的含量较术前明显升高（P＜0.05）,而IL-4和IL-10的含量较术前明显降低（P＜0.05）。AdOX40Ig处理组和FK506处理组的CPM值均明显高于对照组和空载病毒AdEGFP处理组。在BN大鼠与Lewis大鼠的MLR反应体系中,加入重组IL-2,AdOX40Ig处理组和FK506处理组CPM值下降轻,与未加入重组IL-2的CPM值相比,差异有统计学意义。在BN大鼠与F344大鼠的MLR反应体系中,CPM值结果显示对照组、空载病毒AdEGFP处理组和AdOX40Ig处理组相互之间无统计学意义上的差异,但是这三组的CPM值均明显高于FK506处理组。结论（1）熟练和完善的外科操作技术是手术成功的关键;缩短无肝期时间是术后长期生存的有效保障。（2）以近交系Lewis大鼠为供体、BN大鼠为受体的组合发生的急性排斥反应强烈而且稳定,是理想的大鼠肝脏移植急性排斥模型。（3）重组腺病毒pAdOX40Ig构建成功,检测效价达到1010pfu/ml。（4）结果表明10、25、50、100MOI不同剂量病毒感染HL～7702细胞对细胞几乎无毒性,而且呈很高的感染效率,其可达90%以上,这提示10MOI为最佳感染剂量。间接免疫荧光检测结果和ELISA法测定结果均表明,腺病毒介导的外源性OX40基因能在HL-7702细胞中成功表达。（5）用OX40Ig处理供肝具有FK506的抗急性排斥反应的功能,具体表现在,用AdOX40Ig处理的大鼠存活时间长,肝细胞性排斥轻,肝细胞凋亡少,肝功能损害轻,免疫反应向Th2细胞偏移,被抑制的混合淋巴细胞反应能够被IL-2逆转。用AdOX40Ig处理供肝,能够抑制用同品系大鼠的刺激细胞引起的混合淋巴细胞反应,但不能抑制用异品系大鼠的刺激细胞引起的混合淋巴细胞反应,这与FK506不同。