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欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla Linnaeus 1758)简称欧鳗，是我国重要的水产养殖鱼类，对其免疫系统的研究在理论和应用方面都具有重要意义。本文研究了欧鳗血清免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的分离纯化、Ig阳性细胞的组织定位、Ig重链(Immunoglobulin heavy chain，Ign)、Ig轻链(Immunoglobulin light chain，IgL)cDNA的克隆与分析、原核表达以及时空表达等。研究结果为进一步阐明欧鳗免疫应答机理、制备基因工程抗体以及抗体基因转移育种等提供重要的参考依据。主要研究内容及结果如下：
1.采用蛋白A亲和层析和山羊IgG-琼脂糖免疫亲和层析两种方法对欧鳗血清Ig进行分离纯化，同时制备了相应的兔抗欧鳗Ig抗血清。SDS-PAGE凝胶电泳显示：经蛋白A亲和层析纯化后的1g有两条分别为分子量约68ku的重链和26ku的轻链清晰蛋白条带，经山羊IgG-琼脂糖免疫亲和层析纯化后的Ig在SDS-PAGE凝胶有三条清晰的蛋白条带，分别为分子量约68ku的重链、分子量为26ku和28ku的两条轻链；兔抗欧鳗Ig血清经酶联免疫吸附法测定的效价均达到1：51200。Western—blotting结果显示兔抗欧鳗血清能清晰识别欧鳗血清的68ku的重链，约在56ku也出现一条信号较强的蛋白带，但轻链与兔抗鳗鲡Ig抗血清反应较弱。
2.运用免疫组织化学技术研究了嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的实验组欧鳗和未经感染的对照组欧鳗脾脏、肾脏和肝脏Ig阳性(Ig+)细胞定位与分布特点。结果表明：对照组欧鳗脾脏Ig+细胞数较少，肾脏相对较多，肝脏未发现。实验组欧鳗脾脏Ig+细胞数量明显比对照组增多，肾脏有所增多但不明显，肝脏未发现。在实验组和对照组中，黑色素巨噬细胞在脾脏和肾脏中均见明显聚集并与淋巴细胞形成黑色素巨噬细胞中心(Melano-macrophage centres，MMCs)，其中脾脏MMCs多数位于血管附近，脾脏Ig+细胞均主要分布在MMCs及其周边，且在实验组中数量多而密集，而肾脏Ig+细胞在对照组中明显分布于MMCs及其周边，但在实验组不明显。与对照组相比，实验组中脾脏和肾脏黑色素巨噬细胞数量和体积均有明显增多。本试验结果说明欧鳗肾脏和脾脏是具有Ig+细胞的重要免疫器官，其中黑色素巨噬细胞数量和体积变化很可能与免疫应答过程密切相关。
3.采用RT-PCR和RACE方法克隆到的欧鳗IgH全长cDNA共2,089bp，其中所编码的IgH蛋白分子含有581个氨基酸残基，由前导肽、可变区、恒定区1、恒定区2、铰链区、恒定区3、恒定区4以及C末端序列构成。经氨基酸序列分析表明恒定区3区存在其它鱼类未见报道的两个连续糖基化位点，该位点与形成链内二硫键半胱氨酸邻近，且在半胱氨酸下游3bp处发现结合补体Clq的氨基酸基序His-X-Asp-X-X-X-Pro。IgH恒定区的氨基酸序列与海鲢(Elops saurus)、大西洋鲑(Salmo salar)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、草鱼(Ctenopharingodon idella)、鲤鱼(Owrinus carpio)、斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)和斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)的同源性分别为46.1％、39.7％、38.9％、32.4％、32.3％、31.7％和30.7％。
4.根据已经克隆的欧鳗IgH全长cDNA序列构建了欧鳗IgH链重组表达质粒，并在大肠杆菌中实现了高效表达。经Westernblotting分析，目的基因表达产物都能被兔抗欧鳗Ig的抗血清特异性识别，表明原核表达的欧鳗IgH融合蛋白具有天然Ig的免疫原性。
5.采用RT-PCR和RACE方法克隆到的欧鳗IgL全长cDNA共1016bp，其中所编码的IgL蛋白分子含有238个氨基酸残基，由前导肽、可变区和恒定区组成。经氨基酸序列分析后发现两个对IgH和IgL结构域的聚合作用必须的两个基序，分别是位于可变区FR2的PELLT以及位于可变区FR4的FGGG。将欧鳗IgL恒定区序列与其它23种脊椎动物的相应序列进行比较并构建系统发育树，结果显示欧鳗轻链与虹鳟和大西洋鲑轻链L1型群聚为一簇，据此克隆的欧鳗轻链属于轻链L1型。根据已经克隆的欧鳗IgL全长cDNA序列，成功构建了具有双酶切位点欧鳗IgL成熟肽重组表达质粒，为IgL在大肠杆菌中的表达奠定基础。
6.利用荧光定量PCR技术研究了经山羊IgG免疫注射欧鳗前后Ig在肾脏、脾脏、肝脏、鳃、肌肉以及心脏的分布和表达量的变化。之后研究了山羊IgG免疫注射欧鳗后28dIg在肾脏、脾脏和鳃中表达的时空变化。结果表明免疫接种前后欧鳗肾脏、脾脏和鳃Ig基因表达水平均高于肝脏、肌肉和心脏，且免疫后的肾脏、脾脏以及鳃Ig基因表达水平较免疫前均有显著提高。因此欧鳗肾脏、脾脏和鳃应为其主要免疫应答器官。经背部肌肉注射山羊IgG后，欧鳗系统免疫相关器官脾脏和肾脏免疫应答反应分别在第7d和第14d较为明显，而粘膜免疫相关组织鳃在第21d较为明显，说明系统免疫应答反应较粘膜免疫应答反应快。
7.根据欧鳗IgH和IgL基因序列，分别设计了IgH恒定区1、恒定区2、恒定区3以及IgL恒定区特异性探针引物，以欧鳗cDNA为模板进行克隆与测序，进而通过地高辛(DIG)对以上基因片段分别进行标记，制备IgH恒定区1、恒定区2、恒定区3以及IgL恒定区探针。探针标记效率的检测结果显示：IgH恒定区2和恒定区3所标记的探针与对照探针的浓度达0.1pg/μL时均可见到斑点，而对IgH恒定区1和IgL恒定区所标记的探针浓度低至0.03pg/μL尚可见到斑点，表明探针标记均达到预期的效果，其中IgH恒定区1与IgL恒定区探针有更高的标记效率。