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近年来,由于仔猪腹泻而导致仔猪死亡率剧增,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。仔猪腹泻是由多种因素导致的,包括传染性病原感染以及非传染性因素等,且发病率高、死亡率高。引起仔猪腹泻的传染性因素包括细菌、病毒以及其他病原的感染等,前期研究调查表明,由细菌引起的仔猪腹泻在仔猪感染性腹泻中占有较大比重,且近几年,贵州省部分地区规模化养猪场仔猪出现了不同程度的腹泻,发病率及死亡率均有升高。因此,本研究主要开展了贵州省仔猪感染性腹泻流行病学调查、建立分子生物学方法对主要致病菌进行分离鉴定、主要致病菌血清型与毒力基因、耐药表型与耐药基因型等研究与分析,以期为贵州省仔猪细菌性腹泻的科学诊断和综合防控提供重要依据。1.贵州省仔猪感染性腹泻流行病学调查:采用常规流行病学调查方法从病原种类、感染类型、发病季节及地域分布等方面对2011～2015年贵州省9个地(州、市)41个规模化养猪场271例仔猪感染性腹泻病例进行流行情况调查分析,结果表明:①2011～2015年间引起贵州省仔猪腹泻的感染性因素中细菌性感染占48.3%(131/271),病毒性感染占31.0%(84/271),混合感染占20.7%(56/271);②仔猪感染性腹泻主要病原中,分离鉴定的主要细菌性病原菌有大肠埃希氏菌、沙门氏菌、链球菌等,占85.2%(231/271);检测到的主要病毒性病原有猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等,占57.9%(157/271);③仔猪感染性腹泻主要疫病中,细菌性腹泻多发生在春季和夏季,占30.6%(83/271),病毒性腹泻多发生在冬季和春季,占34.7%(94/271),且我省仔猪感染性腹泻的主要疫病的地域分布贵阳地区高于其他地区,占19.0%(48/271)。2.仔猪腹泻主要病原菌三重PCR检测方法的建立:本研究根据Genbank提供的大肠埃希氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌通用鉴定基因参考序列,设计3对特异性引物,以3种细菌阳性菌株基因组DNA为模板,建立了大肠埃希氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌三重PCR检测方法,并对其进行了反应条件的优化。结果显示,所建立的三重PCR反应体系最佳退火温度均为58℃,最适引物浓度分别为0.16μM、0.16μM和0.16μM;大肠埃希氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌最低DNA模板检出量分别为0.3pg/μL、0.22pg/μL、1.24pg/μL,所建立的检测方法特异性、敏感性良好。3.仔猪腹泻主要致病菌的分离鉴定:采集贵州省5个地(州、市)13个规模化养猪场共128份腹泻发病仔猪肠道内容物,通过传统病原学分离鉴定、分子生物学检测以及动物致病性试验等方法进行了主要致病菌的分离鉴定。结果显示:①从腹泻仔猪肠道内容物中共分离鉴定到致病性大肠埃希氏菌78株,分离率60.9%(78/128),与分子生物学鉴定方法相比,大肠埃希氏菌鉴定符合率为85.2%(109/128);②从腹泻仔猪肠道内容物中共分离鉴定到致病沙门氏菌21株,分离率16.4%%(21/128),与分子生物学鉴定方法相比,沙门氏菌鉴定符合率72.4%(21/29);③分离鉴定到葡萄球菌32株,分离率25.0%(32/128),链球菌19株,分离率14.8%(14/128),志贺氏菌4株,分离率3.1%(4/128)、以及其他病原菌如沙雷氏菌、克雷伯氏菌、弯曲杆菌、枸橼酸杆菌、芽抱杆菌、耶尔森菌共31株,分离率 33.6%(53/128)。4.仔猪腹泻主要致病菌血清型与毒力基因型研究:采用血清学方法及分子生物学方法对分离鉴定的致病性大肠埃希氏菌与沙门氏菌进行血清型及毒力基因型的鉴定与析,结果表明:①分离鉴定的78株致病性大肠埃希氏菌,除27株未定型,共测定了 51株致病大肠埃希氏菌血清型,定型株共覆盖8个血清型,以0138、087为主,共31株,占定型菌株的60.8%(31/51);共62株检出毒力基因,检出率79.5%(62/78),其中毒力基因 eaeA、escV、elt 检出率最高,分别为 38.4%(30/78)、21.8%(17/78)、28.2%(22/78)可分为9种毒力基因类型,以elt、eaeA、eaeA+escV3种为主要毒力基因类型,根据毒力基因类型可将致病大肠埃希氏菌分为3种类型肠致病型大肠埃希氏菌(EPEC)、产肠毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)、肠集聚型大肠埃希氏菌(EAEC);②分离鉴定的21株致病性沙门氏菌,除4株未定型外,共测定了 17株沙门氏菌血清型,其中鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌居多,分离率为42.9%(9/21);共18株沙门氏菌检出毒力基因,检出率为85.7%(18/21),其中毒力基因 hilA、siiE、sopB 检出率居高,分别为 42.9%(9/21)、76.2%(16/21)、76.2%(16/21),可分为7种毒力基因型,其中以同时携带siiE/sopB、siiE/sopB/hilA为主要毒力基因型。5.仔猪细菌性腹泻主要致病菌耐药性研究:采用药敏纸片法对分离鉴定的78株致病性大肠埃希氏菌和21株沙门氏菌进行12种抗菌药物的耐药表型测定,并利用PCR扩增技术检测各菌株14种耐药相关基因,分析细菌耐药表型和耐药基因型相关性。结果显示:①分离鉴定的78株致病大肠埃希氏菌对青霉素、氨苄西林、庆大霉素高度耐药,耐药率分别达到94.9%(74/78))、92.3%(72/73)、89.7%(70/78),且分离株均多重耐药;14种耐药基因共检出12种,耐药基因aaC2、aphA、TEM和SHV检出率最,分别为82.1%(64/78)、71.8%(56/78)、44.9%(35/78)、47.1%(37/78);致病大肠埃希氏菌对β酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类药物耐药表型与耐药基因型的符合率分别为66.2%(49/74)、82.9%(58/70)、72.9%(35/48)和 75.9%(41/54);②分离鉴定的 21 株沙门氏菌对丁胺卡那、卡那霉素和磺胺甲恶唑高度耐药,耐药率分别为61.9%(12/21)、57.1%(10/21)和47.6%(9/21),且分离株均多重耐药;14种耐药基因共检出10种,耐药基因 aaC2、aaC4、sul1 和 SHV 检出率最高,分别为 66.7%(14/21)、66.7%(14/21)、52.4%(11/21)和42.9%(9/21);沙门氏菌对β酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类和喹诺酮类药物耐药表型与耐药基因型的符合率分别为100%(9/9)、62.8%(5/8)、81.8%(9/11)和73.3%(11/15)。结论:1.明确了引起我省仔猪感染性腹泻的主要类型为细菌性感染,与其他感染类型相比所占比例较高;仔猪细菌性腹泻多发生春季和夏季;我省仔猪感染性腹泻主要疫病地域分布存在着显著差异。2.本研究成功建立了大肠埃希氏菌、沙门氏菌和志贺氏菌三重PCR检测方法,且该方法敏感性高、特异性好,能用于临床诊断。3.明确了致病性大肠埃希氏菌与沙门氏菌为引起我省仔猪细菌性腹泻的主要致病菌,并通过分子生物学方法和传统方法可准确鉴定两种主要致病菌,鉴定符合率较高。4.研究表明贵州省仔猪细菌性腹泻主要致病菌血清型和毒力基因型种类多样,其中致病性大肠埃希氏菌中EPEC、ETEC是导致我省仔猪腹泻的最重要的大肠埃希氏菌病原,且血清型以0138、087居多;引起我省仔猪腹泻沙门氏菌中毒力基因以siiE、sopB检出最多,血清型以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌为主要血清型。5.贵州省仔猪腹泻主要致病菌存在广泛耐药,多重耐药种类达8种以上;检出的耐药基因种类众多,且耐药表型和耐药基因型符合率高度统一。