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研究背景:心血管疾病引起的血管阻塞仍是全球范围内导致患者死亡的重要原因,尽管球囊血管成形术等传统手术已经得到了发展,但仍有许多患者需要接受血管移植手术,如冠状动脉搭桥手术。此外还有许多疾病治疗需要使用血管替代物进行移植,例如血液透析患者的动静脉分流术,创伤导致血管损伤患者的血管移植术等。目前自体移植物例如胸廓内动脉和隐静脉是冠脉搭桥的金标准移植物,但静脉在移植到需要承受高压的动脉部位时长期表现不够好,还有很多患者由于健康状况较差而使得自体血管无法用于移植。在其他的血管移植术中,各种高分子材料的人工血管移植物成为自体血管的替代品,如膨体聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene,e-PTFE）,但是其生物相容性、顺应性等方面有很多不足,当其口径较小时易形成血栓,限制了其临床应用。在过去的十几年里,血管组织工程已经成为发展最快的研究领域之一。血管组织工程的目的是综合应用材料学、生物学设计出有活性的性质与天然血管相似的组织工程血管（tissue engineered blood vessel,TEBV）。但目前TEBV仍然存在制备周期较长、细胞来源有限、力学性能不足、植入后易形成血栓等诸多缺点。天然血管之所以具有完备的生物学功能和优异的力学性能,与其组成和结构密切相关。血管由内膜、中膜和外膜三层结构组成,内膜为内皮细胞层,能够调控凝血平衡,防止血栓形成;中膜由定向排列的平滑肌、弹性纤维和胶原纤维组成,提供了主要的力学强度;外层为包含成纤维细胞和外周神经的结缔组织。本研究从仿生学角度出发,针对TEBV的构建进行了以下几个方面的研究。研究方法:血栓形成是TEBV植入体内后首先需要解决的问题。TEBV作为外源异物,植入后容易造成血小板的活化、聚集以及后续的凝血反应,在这个过程中,活化的血小板释放的高浓度二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）起到了重要促凝作用。人体血管内皮细胞表面的两种胞外核苷酸酶:CD39与CD73,对ADP浓度起到调节作用,然而TEBV在体内完成内皮化需要较长的时间。为了实现早期抗凝,我们以还原氧化石墨烯（reduce graphene oxide,r GO）作为载体,将CD39与CD73两种酶蛋白通过共价键结合在其表面,随后将r GO-酶复合物修饰在脱细胞血管表面,进行了体外和大鼠体内的酶活性、抗凝抗血栓等功能的验证。随后,我们解析天然血管的成分和微结构,制备出具有仿生定向排列纤维结构的高强度双网络水凝胶血管。动物来源的脱细胞血管尽管有着力学性能好、来源广的优点,但异种材料引起的免疫排斥和尺寸口径不能自由选择的缺点限制了其应用。水凝胶是广泛应用于组织工程的材料,但能够承受较大压力或张力的水凝胶工程化组织仍较少见,力学强度不足仍是其最大的短板之一。我们首先设计了可以快速温和制备的光固化双网络（double-network,DN）水凝胶,并在其中添加了碳纳米管（carbon nanotube,CNT）,模仿天然血管纳米纤维结构,通过能量耗散机制和纤维网络提高整体的强度和顺应性。随后利用该水凝胶通过3D打印技术制备出血管结构后,对其进行限制性风干处理（Restricted air drying,RAD）,以得到类似天然血管的分层级定向排列纤维结构,最终得到RAD-CNT-DN高强度水凝胶血管。单纯的水凝胶血管仍不具备天然动脉血管的分层结构,且不易直接接触血液。最后我们复合PCL纤维膜、生物膜和上述合成的DN水凝胶,并利用细胞3D打印和细胞种植技术,制备出三层结构细胞化小口径血管。我们使用脱细胞血管内膜作为血管的内层分隔水凝胶与血液,起到类似血管内弹性膜的物理分隔作用,并提供一定的力学强度。在外面包被一层使用微纳3D打印技术制备的PCL纤维膜,PCL纤维具有交错的定向排列结构,与血管中层定向排列的纤维,可以提供足够的力学强度。外层使用含有人脐带来源间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）生物墨水打印细胞层。随后将诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PS cells）定向诱导分化为血管内皮细胞,使用自行搭建的血管灌流培养系统将其种植在血管内表面,得到内皮化的三层血管。研究结果:血管表面功能仿生的实验结果表明,CD39与CD73形成的嘌呤能通路,能在生理条件下将局部微环境中血小板活化释放的ADP转化为一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）和腺苷,两者能够起到调控微环境、防止血栓形成并促进内皮化的作用。片状结构的r GO不仅能够保证级联酶促反应的顺利进行,而且能够增强酶蛋白在血管内表面的分散程度和稳定性。动物实验结果表明,r GO-酶修饰后的TEBV相比未修饰的血管更不易形成急性血栓,内皮化程度更好,能够保持通畅。微结构仿生实验结果表明,快速合成的DN水凝胶通过能量耗散提升了强度和韧性。在RAD处理过程中,水凝胶血管内部在特定方向产生的应力使得高分子聚合物逐渐形成分层级的定向排列纤维结构,该结构与血管壁的纤维排列结构类似。力学测试结果表明,我们制备的水凝胶血管弹性模量、断裂强度、极限形变和爆破压力都有显著提升,顺应性更加接近天然血管。三层血管制备的体外实验结果表明,MSC细胞在水凝胶内三维生长状态良好,细胞在PCL纤维引导下沿着纤维方向生长。血管内表面种植的内皮细胞在冲刷力作用下定向排列,接近天然血管内皮细胞排列方式。对三层血管进行了初步的大鼠体内移植实验,结果表明MSC细胞可以存活7d以上,种植了内皮细胞的血管更不容易形成血栓,移植14d后保持通畅。结论:综上所述,本论文通过对血管功能和结构的解析进行仿生设计,首先制备出具有仿生内皮细胞涂层的抗血栓TEBV,然后利用水凝胶材料和3D打印技术,制备出具有类似天然血管纤维微结构的高强度水凝胶血管,最后复合使用脱细胞材料、高分子材料和含细胞水凝胶,制备出三层仿生血管,并进行了动物体内移植实验。该方法将之前需要两周以上的体外培育过程缩短到一天以内。3D打印技术可以灵活地调整血管口径和长度。结果表明,这些仿生手段能够实现血管内表面抗血栓,快速制备出具有优良力学性能的小口径血管,为体外设计制备TEBV提供了新的方法和思路。