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第一部分 肠道菌群与肠神经胶质细胞在改善肠神经发育不良中的机制研究研究背景:肠神经发育不良（Intestinal neuronal dysplasia,IND）和先天性巨结肠（Hirschsprung disease,HSCR）同属于肠神经发育异常性疾病（Neuronal intestinal malformations,NIM）,发病率仅次于HSCR,其病理表现以肠管黏膜下及肌间神经节无功能增生或局限性神经丛过度发育为主,临床表现以顽固性便秘甚至肠梗阻为主要表现,与HSCR相似。IND与HSCR本质上属于肠神经系统（Enteric nervous system,ENS）向远端肠管迁移、增殖及分化过程中出现障碍或异常的两种不同结局。但由于IND发病机制尚不明确,缺乏特异性的影像学及其他辅助检查手段,诊断的“金标准”仍有赖于活检或术后病理,对临床上的诊断和治疗造成一定困扰。因此,探索IND的发病机制,了解ENS发生发育过程中的干扰及干预因素,对日后探究IND新的诊疗及防治手段具有重要意义。传统的观念认为,胚胎发育期受到多种致病因素影响导致ENS发育异常,导致肠道功能障碍。但随着对胚胎学研究的深入,人们发现随着胎儿的娩出,ENS的发育并不会停滞,肠神经嵴细胞（Enteric neural crest-derived cells,ENCCs）仍然会在新生儿肠管中迁移、分化和发育,尤其是突触的发生与相互连接,在新生儿生后一段时间是重要的发育期,而这一时期也恰恰正是肠道菌群形成及建立的关键时期。文献表明,早期肠道菌群的建立和完善对ENS的出生后继续发育起着重要作用,同时正常微生物菌群在日常维持ENS功能、调节免疫、影响激素分泌等诸多方面均有着不可或缺的作用。肠道菌群主要分为三种:益生菌、条件致病菌和病原菌。正常情况下,双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳酸杆菌（Lactobacillus）作为肠道主要的正常优势菌种,占到了菌群数量的90%以上,而如果肠道菌群平衡被打破,导致条件致病菌或病原菌过度增殖,产生毒力因子,就会破坏肠粘膜屏障导致疾病。其中,金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxin,SE）属于葡萄球菌和链球菌产生的毒素大家族,能够穿透肠粘膜屏障,引起毒素休克综合征、食物中毒和多种自身免疫性疾病。既往研究已知肠神经胶质细胞（Enteric glial cells,EGCs）受到外来抗原刺激后会分泌细胞因子及趋化因子,参于肠道炎症过程及免疫调节,同时EGCs可以与免疫效应细胞、肠内分泌细胞、上皮细胞形成一个从肠神经元（Enteric neuron cells,ENCs）到其它细胞结合反应的双向信号通路,因此我们猜测EGCs是调控ENS与肠道菌群之间相互作用的重要中间媒介。然而,益生菌能否通过调动EGCs的功能调节来达到对ENS的保护作用,以及致病菌产生的毒力因子如何影响EGCs的活性?目前尚未明确。因此,我们尝试通过体外细胞实验验证EGCs对金黄色葡萄球菌肠毒素A型（Staphylococcal enterotoxin A,SEA）的易感性及反应特性,并通过动物双歧杆菌干预IND动物模型的体内实验,进一步验证在ENS及EGCs发育不良的情况下,双歧杆菌是否通过增加EGCs的活性,对ENS产生保护作用,达到改善IND症状的目的。目的:研究EGCs对常见致病菌抗原物质SEA的反应特性及动物双歧杆菌通过EGCs改善IND模型小鼠结肠动力中的作用机制。方法:1.细菌毒素刺激细胞实验:通过在EGCs细胞培养基中不同浓度的SEA干预,通过酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）、细胞免疫荧光（immunocytofluorescent,ICF）等检测在不同时间点经不同浓度处理后的EGCs的标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）及胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF）的变化;2.动物实验:①通过Southern Blot筛选出纯合子Tlx2--IND模型小鼠,通过蛋白印迹实验（Western Blot,WB）、实时荧光聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）、Elisa、免疫组织化学染色（Immuohistochemistry,IHC）实验评估其肠道中EGCs的发育情况,并与野生型（Wild Type,WT）对照;②通过培养双歧杆菌活菌,并利用活菌菌液干预纯合子IND模型小鼠,改变IND模型小鼠的菌群结构,并通过16s rDNA测序验证双歧杆菌在模型小鼠肠道中的定植;③通过对纯合子IND模型小鼠干预前后症状体征的测量及评估,证实结肠动力的改善情况;④通过WB、PCR及Elisa等实验再次评估干预后模型小鼠肠道中EGCs的标志物及GDNF-GFRα（GDNF family receptor alpha）通路的变化情况,并与控制组对照。结果:1.细菌毒素SEA能以剂量和时间依赖性方式引起EGCs细胞病变效应,随着SEA刺激时间的增长和浓度的增加,EGCs呈现回缩和变圆,细胞透光度增加,呈现细胞病变效应;2.EGCs在外来抗原的刺激下反应性形成“活化状态”,ICF染色下细胞体积增大,细胞凸起更加明显;3.EGCs在细菌抗原刺激下产生GDNF的反应特性;4.纯合子Tlx2-/-敲基因模型小鼠中EGCs存在发育异常;5.16s rDNA测序证实双歧杆菌活菌灌肠能够增加Tlx2-/-小鼠肠道中双歧杆菌的定植;6.Tlx2-/-小鼠模型经益生菌干预后结肠中EGCs数量增加,结肠动力改善,结肠中GFRα受体表达增加,血清中GDNF含量增加（P＜0.05）。结论:1.细菌毒素SEA能以剂量和时间依赖性方式引起EGCs细胞病变效应,并促使EGCs在一定承受范围内产生“活化状态”并产生GDNF帮助抵御外来抗原,进而对ENCs产生保护作用;2.EGCs能够对肠道菌群的反应性使之成为肠道菌群与ENS之间相互作用的重要中间媒介;双歧杆菌可能通过EGCs的GDNF-GFRα通路激活过程并使之产生神经营养因子,对IND动物模型的症状及结肠动力有改善作用。第二部分 肠神经胶质细胞在先天性巨结肠中的异常发育研究研究背景:先天性巨结肠症,又称赫普希龙病（Hirschsprung disease,HSCR）,是一种ENS发育异常性疾病,其结肠远端由于缺乏神经节细胞,导致该结肠段无法正常蠕动,从而引起结肠运动障碍。患儿通常在出生后不久即出现远端肠梗阻的体征,具体表现为胎粪排出延迟、顽固性便秘、腹胀呕吐等,如不及时干预及治疗,甚至可出现巨结肠相关性小肠结肠炎（Hirschsprung-associated enterocolitis,HAEC）等严重并发症。HSCR 目前的主要治疗方式为手术切除病变肠段。虽然大多数患儿通过手术治疗达到了良好的治疗效果,但仍有相当数量的患儿存在术后慢性肠动力障碍和（或）便秘等问题,甚至于部分患儿术后存在反复发作的小肠结肠炎,这些并发症的产生或许与患儿术后近端肠管仍存在功能不全的神经节细胞有关。因此,了解ENS的生物学发育过程,有助于我们完善HSCR的病因学机制和病理生理过程,寻找特异性高的诊断指标,提高现有诊断方法的准确性,帮助HSCR的诊断和治疗。作为人体的第二大神经系统,ENS由胚胎时期的肠神经嵴细胞（Enteric neural crest-derived cells,ENCCs）发育而来,在调控肠道运动、营养吸收、免疫反应、血运等方面发挥重大作用。人体胚胎发育第4周时,ENCCs开始向肠壁定植并沿着肠道的发育向尾端进行迁移,在此过程中,ENCCs逐渐增殖分化成为ENCs、EGCs及Cajal细胞等不同种类的肠道细胞群,并彼此相互连接聚集形成多个神经丛,从而调节肠道功能。其中EGCs作为ENS的重要组成成分且形态近似于中枢神经系统（Central nervous system,CNS）中的星型胶质细胞（Astrocyte）,分布于肠壁全层,由多种亚型组成,可特异性表达胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）、S100钙结合蛋白β（S100 calcium-binding protein β,S100β）等星形胶质细胞特异性神经标记物及多种神经营养因子（Neurotrophic factors,NFs）,在维护肠道上皮屏障、介导肠道炎症反应及免疫反应中发挥重要作用。近年来随着人们对消化道疾病研究的逐渐深入,EGCs在炎性肠病的调控、肠道肿瘤的发生发展等方面的作用逐渐得到认识,但在结肠动力性疾病中的相关研究较少。近期人们研究发现结肠慢传输（Slow transit constipation,STC）的病人肠管中EGCs数量减少;国外的研究亦显示,在EGCs缺陷的小鼠模型表现出明显的结肠动力性障碍,因此提示我们,EGCs作为ENS的重要组成部分,在结肠动力性疾病中的作用逐渐得到认识,EGCs的减少可能会引起肠动力下降,但其具体作用机制有待探讨。HSCR作为一种先天性结肠动力障碍性疾病,由于其远端肠管无法正常蠕动,近端粪便堆积,形成了狭窄段近端扩张的“巨结肠”典型病变特征。在HSCR的手术中,准确判断病变肠管范围,完整切除病变节段,确保所保留的近端肠管功能良好,对于降低术后并发症的发生和二次手术风险至关重要。随着EGCs在维持ENS功能中的重要性得到逐渐认识,评估EGCs在HSCR肠管中的分布和发育,有利于保留功能良好的近端肠管。所以HSCR术中除了应对ENCs有着准确的识别和判断,了解病变肠段中EGCs与ENCs的位置关系,有利于对于手术肠管切除范围的精准选择。人们对于HSCR病变节段中的ENCs的病变情况研究较多,但EGCs的分布特点和发育状况尚待进一步明确,因此我们通过WB、PCR、IF等分子生物学技术,对HSCR病变肠管各节段中的EGCs发育及分布情况及其与肌间神经节中ENCs的位置关系进行了评估。目的:研究EGCs在HSCR病变肠管中的异常发育及其与ENCs的分布关系。方法:1.标本收集及筛选:收集2018年12月到2020年12月于山东大学齐鲁医院小儿外科行手术治疗的35例HSCR患儿切除病变肠管,并收集归纳其临床及影像学资料,并利用HE染色和乙酰胆碱酯酶染色验证HSCR结肠标本诊断的准确性;2.WB:应用蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）对EGCs标志物GFAP、S100β在病变肠管不同节段中的蛋白表达量进行检测;3.PCR:通过聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）对病变肠管不同节段中GFAP及S100β mRNA水平的表达量进行检测;4.IF:利用组织切片免疫荧光双染（Double immunofluorescence labeling,IF）对不同节段中ENCs标记物HuC/HuD及EGCs两种标记物分别进行荧光标记,分析结肠肌间EGCs与ENCs的发育及分布关系;5.IHC:通过免疫组织化学染色（Immuohistochemistry,IHC）显示各节段结肠标本中GFAP、S100β的染色水平及肌间位置分布。结果:1.与内参基因GAPDH相比,4部分病变肠管（近端段、扩张段、移行段及狭窄段）中EGCs标志物GFAP和S100β的蛋白和mRNA表达水平从近端段、扩张段、移行段到无神经节段的表达有下降的趋势（P＜0.05）;2.病变肠管切片中GFAP和S100β及经典肠神经元标志物HuC/HuD IF双染显示无神经节细胞段无明显EGCs及ENCs 阳性染色,移行段、扩张段纵行肌与环行肌之间阳性染色形态不规整,发育畸形,而近端段EGCs位于ENCs周围,肌间神经节形态相对完整;单位面积目的基因荧光强度（AU）进行定量分析,显示4部分肠管中EGCs标志物与HuC/HuD一致的变化趋势（P＜0.05）。3.IHC染色中GFAP和S100β于无神经节细胞段未见明显阳性染色,而移行段、扩张段和近端段的纵行肌与环行肌之间,分别可见数目不等的阳性染色颗粒,其中移行段阳性染色颗粒明显减少,形状不规则,形态畸形。IHC单位面积阳性定量结果与蛋白及mRNA的定量结果一致。结论:1.在HSCR患儿的病变肠管中,EGCs的发育及分布与ENCs呈现一致性,无神经节肠段肌间EGCs存在明显的数量减少及发育异常;2.EGCs的标志物GFAP及S100β在4部分病变肠管中呈现逐渐变化的趋势,通过检测GFAP和S100β,其可以对ENS的发育状态提供线索,切除边缘的良好功能和形态的EGCs可亦为手术切除的范围提供参考。