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目的:Ⅰ型糖尿病(Type1 diabetes，T1D)是一种胰岛β细胞被自身反应性CD4+和CD8+T细胞介导破坏后，胰岛素分泌绝对不足而造成的自身免疫性疾病。现已公认，在非肥胖性糖尿病(nonobese diabetic，NOD)小鼠和Ⅰ型糖尿病患者中，自身反应性CD4+T细胞和CD8+细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)均是发病中不可缺少的效应细胞。对胰岛β细胞的自身免疫攻击进行抗原特异性的免疫干预与阻断，可以重新建立机体对胰岛β细胞自身抗原的免疫耐受，是一种可能从根本上预防T1D发生和发展的理想途径，故寻找T1D发病过程中重要的靶标抗原以诱导免疫耐受具有重要意义。大多数胰岛β细胞自身抗原都可以被CD4+T细胞和CD8+T细胞识别，如胰岛素(insulin)、谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）和胰岛特定的葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-relatedprotein，IGRP)。嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A，ChgA)是近几年刚被发现的T1D相关抗原，它可以被NOD小鼠和人类的CD4+T细胞识别，但能否被CD8+T细胞所识别还未知。HLA-A*0201是亚洲及高加索人群中的高频等位基因（HLA-A2超型占有比例为50％），研究发现该基因与T1D高患病风险有一定相关性。国外David VS研究小组建立了一个HLA-A*0201转基因NOD小鼠模型——NOD.β2mnullHHD小鼠，并证实了该人源化NOD小鼠模型能被用于HLA-A*0201限制性的T1D优势CD8+T细胞表位的鉴定，从而解决了实验研究中胰腺组织样本极少且很难获取，外周血中自身反应性CD8+T细胞数量极少的问题，使关于T1D患者HLA-A*0201限制性CD8+T细胞表位鉴定的研究得到了极大的发展。本研究预测并初步合成了HLA-A*0201限制性T1D相关抗原ChgA的CD8+T细胞表位肽，对继续深入研究HLA-A2超型表位有较大的参考价值，对T1D基于超型表位的耐受诱导治疗提供新的候选靶标抗原表位具有一定价值。 方法:使用SYFPEITHI、IEDB和NETMHC三个表位预测网站进行预测，对预测结果进行综合分析，得到与HLA-A*0201限制性候选表位肽，再应用间接荧光标记法检测候选表位肽与HLA-A*0201的相对亲和力。再进行体外细胞功能试验，通过Elispot Assay检测候选表位肽诱导小鼠脾淋巴细胞IFN-γ表达的能力，使用[3H] thymidine掺入法检测表位肽诱导脾淋巴细胞增殖的能力，利用以上两个实验对候选表位肽进行初筛;再通过胞内因子染色流式细胞术分析表位肽特异性CD8+CTL表达IFN-γ、IL-17的水平判断其诱导细胞因子的能力，同上方法检测其诱导表达perforin的水平以判断细胞毒作用的大小，并利用HLA-A2抗体阻断T2抗原提呈，以判定IFN-γ、IL-17和perforin由CD8+CTL表达。结果:1.通过分析归纳SYFEPITHI、IEDB和NETMHC三个在线表位预测网站的结果，预测得到HLA-A*0201限制性的四条候选表位肽ChgA10-19、ChgA43-52、ChgA8-16和ChgA75-84。合成后通过HPLC检测纯度大于95％，通过质谱检测分子量与理论值吻合。2.通过间接免疫荧光法检测四条抗原表位肽与HLA-A*0201分子的相对亲和力，得到各抗原表位肽的相对荧光强度FI。ChgA10-19和ChgA43-52的相对荧光强度分别为2.74±0.37、3.56±0.41，高于IGRP206-2140.70±0.07，P＜0.05; ChgA8-16和ChgA75-84的相对荧光强度为0.83±0.20、0.77±0.04，与IGRP206-214对比统计学无差异，P＞0.05。与HIVpol476-4842.33±0.08对比，ChgA10-19组无差异，P＞0.05，其他三组有差异，P＜0.05。3.通过[3H]胸腺嘧啶摄取法评价候选表位肽刺激脾淋巴细胞增殖，得到检测射线的每分钟计数次数(cpm)。ChgA10-19和ChgA43-52的CPM分别为7807±524、8166±714，高于medium3116±195，P＜0.05;ChgA8-16和ChgA75-84的CPM为3556±360、3766±334，与medium组对比统计学无差异，P＞0.05。与InA2-10组CPM8931±768对比，ChgA10-19组和ChgA43-52无差异，P＞0.05，另外两组组有差异，P＜0.05。4.通过ELISPOT斑点酶联免疫分析检测四条肽诱导刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ的能力，得到IFN-γ斑点数。ChgA10-19和ChgA43-52诱导产生的斑点数分别为71.00±7.81和54.00±4.58，高于medium组23.00±4.00，P＜0.05。ChgA8-16和ChgA75-84诱导产生的斑点数分别为20.00±1.73和25.67±1.20，与medium组对比无统计学意义，P＞0.05。与InA2-10组80.67±5.81相比，ChgA8-16、ChgA10-19与ChgA43-52与组有差异，P＜0.05，ChgA75-84无差异，P＞0.05。5.配合使用HLA-A*0201分子抗体，应用流式细胞术胞内因子染色检测CD8+T细胞IFN-γ、IL-17、perforin的表达比例(％)。IFN组中，ChgA10-19(-)与ChgA43-52(-)组的比例分别为22.23±5.04和15.13±3.99，高于medium组0.93±0.27，P＜0.05; ChgA10-19(+)与ChgA43-52(+)组的比例分别为0.80±0.58和0.90±0.06，与medium组对比无差异，P＞0.05。与ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差异，P＜0.05;与ChgA43-52（-）相比，ChgA43-52(+)有差异，P＜0.05。 IL-17组中，ChgA10-19(-)与ChgA43-52(-)组的比例分别为52.23±7.98和45.13±5.23，高于medium组6.63±0.59,P＜0.05; ChgA10-19(+)与ChgA43-52(+)组的比例分别为6.73±0.12和6.40±0.25,与medium组对比无差异，P＞0.05。与ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差异，P＜0.05;与ChgA43-52(-)相比，ChgA43-52(+)有差异，P＜0.05。Perforin组中，ChgA10-19(-)与ChgA43-52(-)组的比例分别为17.27±2.69和15.13±173,高于medium组3.50±0.49, P＜0.05; ChgA10-19(+)与ChgA43-52(+)组的比例分别为4.63±0.38和0.77±0.09,与medium组对比无差异，P＞0.05。与ChgA10-19(-)相比，ChgA10-19(+)有差异，P＜0.05;与ChgA43-52(-)相比，ChgA43-52(+)有差异，P＜0.05。结论:候选表位ChgA10-19和ChgA43-52与HLA-A*0201等位基因的亲和力明显高于ChgA8-16和ChgA75-84，是有明显的免疫优势的HLA-A*0201限制性表位肽。