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目的探讨CD137分子对载脂蛋白E基因敲除小鼠(Apo E-/-小鼠)动脉粥样斑块及血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的影响。方法本实验包括体内实验和体外实验两部分。(1)体内实验:Apo E-/-小鼠给予高脂饮食诱导动脉粥样硬化及钙化模型,分别用刺激型CD137抗体、抑制型CD137抗体激活或抑制CD137分子。对各组小鼠主动脉行组织形态学分析并予Masson染色及ALP染色,用Von kossa染色比较各组斑块钙化程度、免疫组化染色检测斑块中骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein 2,BMP-2)及Runx2蛋白表达水平。(2)体外实验:采用组织块贴壁法分离、培养C57BL/6J小鼠主动脉VSMCs,免疫荧光染色鉴定细胞纯度;用β-甘油磷酸钠诱导VSMCs钙化,以刺激型CD137抗体、抑制型CD137抗体激活或抑制CD137分子;细胞钙化及细胞内钙离子含量分别采用von kossa染色和甲基百里香酚蓝法检测,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组VSMCs骨形成相关蛋白BMP-2和Runx2m RNA的表达水平、蛋白印迹法(Western blot)检测BMP-2、Runx2蛋白表达水平。结果(1)各组内均可见小鼠主动脉内膜增厚及粥样斑块形成。给予刺激型CD137抗体激活CD137分子后,小鼠粥样斑块及钙化面积增加,血管壁肌纤维减少,斑块内见大量圆形或椭圆形、胞质嗜碱性的骨样细胞生成;而同时给予抑制型CD137抗体可部分逆转这种现象。(2)ALP染色结果显示,ALP在钙盐沉积部位活性较高,CD137刺激组斑块内ALP活性较对照组明显升高;而CD137抑制组斑块内ALP活性较刺激组下降。(3)免疫组织化学染色结果显示,对照组粥样斑块中BMP-2、Runx2表达较低;CD137刺激组BMP-2和Runx2的表达显著增加;而CD137抑制组BMP-2、Runx2的表达量与CD137刺激组相比有所下降。(4)组织块贴壁法分离、培养的小鼠VSMCs可见“谷峰样”生长;第3代细胞经免疫荧光鉴定其纯度达95%。(5)VSMCs经刺激型CD137抗体处理后,VSMCs的钙化较对照组而言明显加重;而经过额外的抑制型CD137抗体预处理后,刺激型CD137抗体的这种加强VSMCs钙化的作用被削弱。(6)CD137刺激组VSMCs钙含量和ALP活性较对照组增加(分别为P<0.01,P<0.05),而CD137抑制组VSMCs钙含量、ALP活性较刺激组均下降(分别为P<0.01,P<0.05)。(7)刺激型CD137抗体处理VSMCs后,细胞内BMP-2、Runx2的m RNA及蛋白表达水平较对照组升高;予抑制型CD137抗体预处理后,BMP-2、Runx2m RNA及蛋白表达水平较刺激组下降。结论(1)激活CD137能够促进Apo E-/-小鼠粥样斑块及VSMCs钙化;(2)CD137可参与调节VSMCs向骨样细胞表型转化。