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目的
本研究以患病率较高、影响较大、耗费卫生医疗资源较多的功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)为切入点，结合FD以胃动力障碍为主要病理生理基础的特点，以Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)为胃慢波的起搏细胞和微小RNA(microRNA，miRNA)能够通过调控靶基因、靶信号通路途径调节细胞的增殖、分化、自噬等细胞效应为前提，探讨miRNA调控ICC在电针治疗FD大鼠改善其胃动力过程中的作用机制。
方法
采用SPF级健康成年雄性SD大鼠18只，适应性饲养1周后随机分为空白对照组(control group)、模型组(model group)、电针组(EA group)，每组6只。除空白对照组外，其他两组大鼠均予以多因素应激干预法构建FD模型，造模周期为14天。造模成功后，予以电针干预足三里穴和太冲穴，电针干预周期为10天。电针干预期间，观察各组大鼠的一般情况，并测量具体的体重、饮食量和饮水量。电针干预结束后，采用营养半固体糊对大鼠进行灌胃(2mL/100g)，30分钟后再予以戊巴比妥钠腹腔注射(5mg/100g)依次麻醉大鼠，麻醉成功后对大鼠进行解剖取材，称取每只大鼠的胃全重和胃净重，计算大鼠胃内残留率。将胃称重后，切取部分胃窦组织，采用苏木素-伊红染色观察各组大鼠胃窦组织形态结构；运用透射电镜观察各组大鼠胃窦组织内ICC的超微结构；采用免疫印迹法检测各组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平；运用miRNA测序筛查电针干预FD大鼠前后差异性表达的miRNA，并通过双荧光素酶报告基因检测验证差异性表达的miR-X与c-kit基因(KIT)之间的靶向关系；采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠胃窦组织c-kitmRNA和差异性miR-X的相对表达水平。
采用SPF级健康成年雄性SD大鼠30只，适应性饲养1周后随机分为空白对照＋空载组(control＋NC)、模型＋空载组(model＋NC)、电针＋空载组(EA＋NC)、电针＋干扰组(EA＋miR-Xinhibitor)，电针＋过表达组(EA＋miR-Xagomir)，每组6只。除空白对照组外，其他各组大鼠均予以多因素应激干预法构建FD模型，造模周期为14天。造模成功后，电针干预足三里穴和太冲穴，电针干预周期为10天；期间将构建的miR-X过表达和干扰载体，通过尾静脉注射途径注入相对应的各组大鼠。电针干预期间，观察各组大鼠的一般情况。电针干预结束后，采用同前方法计算大鼠胃内残留率。切取部分胃窦组织，采用苏木素-伊红染色观察各组大鼠胃窦组织形态结构；采用免疫印迹法检测各组大鼠胃窦组织CX43、SCF、c-kit、p-Raf/Raf、p-Erk/Erk蛋白的表达水平；采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠胃窦组织CX43、SCF、c-kit、Raf、ErkmRNA和miR-X的相对表达水平。
结果
1.电针干预对FD大鼠的影响及电针干预前后差异性miRNA的筛查
(1)FD大鼠模型的构建：观察到造模后大鼠体重下降，饮食量和饮水量减少；毛发枯乱发黄、掉毛；大便溏稀，且有较重的酸腐臭味；活跃程度减弱，抓捕反应迟钝，基本无攻击性和防御性；精神疲倦萎靡，状态不佳。对大鼠胃窦组织进行苏木素-伊红染色观察其形态结构未发现明显的器质性病变。
(2)电针对FD大鼠一般行为学的影响：在造模前(0d)，三组间大鼠体重、饮食量、饮水量差异均无统计学意义(P＞0.05)。造模结束后(14d)，模型组和电针组大鼠体重、饮食量、饮水量均下降，两组间差异均无统计学意义(P＞0.05)；模型组、电针组大鼠体重、饮食量、饮水量分别与空白对照组相比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。经过10天的电针干预后(24d)，电针组和空白对照组大鼠体重、饮食量、饮水量显著增长，模型组大鼠体重、饮食量、饮水量也出现增加，但三组间比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
(3)电针对FD大鼠胃动力的影响：模型组和电针组大鼠胃内残留率明显高于空白对照组，而电针组大鼠胃内残留率明显低于模型组，三组间比较，差异均具有统计学意义(F=185.637，P＜0.001)。
(4)电针对FD大鼠胃窦组织ICC的影响：透射电镜下观察可见空白对照组ICC呈纺锤形或不规则多边形，细胞核较大呈卵圆形，核周边缘呈异染色致密带，细胞质较少，胞质内有丰富的线粒体等细胞器，自噬体少见。模型组ICC超微结构受到破坏，细胞核较大，细胞质内细胞器明显减少，可见明显的自噬体。电针组ICC呈纺锤形或不规则多边形，细胞核较大，细胞质内细胞器较多，线粒体肿胀不明显，自噬体结构不明显。通过免疫印迹法检测发现，模型组和电针组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显低于空白对照组，而电针组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显高于模型组，三组间比较，差异均具有统计学意义(F=556.283，P＜0.001)。
(5)电针干预FD大鼠前后差异性表达的miRNA筛查：总共有18种，其中下调miRNA有13种，上调miRNA有5种；通过Ensembl数据库和TargetScan数据库分析发现，差异性表达的18种miRNA中只有miR-221-3p与c-kit基因(KIT)的3’UTR存在互补位点。
(6)miR-221-3p和c-kit基因的靶向关系验证：转染c-kit3’UTR野生型(WT)载体质粒组，miR-221-3pmimic组的荧光素酶活性明显受到抑制，与miR-221-3pnc组相比，组间差异具有统计学意义(t=24.595，P＜0.001)；转染c-kit3’UTR突变型(MUT)载体质粒组，miR-221-3pnc组与miR-221-3pmimic组的荧光素酶活性比值相比较，差异无统计学意义(t=-0.254，P＞0.05)。模型组和电针组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显低于空白对照组，但大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显高于空白对照组。电针组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显高于模型组，但大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显低于模型组。三组间比较，差异均具有统计学意义(Fc-kitmRNA=285.762，Pc-kitmRNA＜0.05；FmiR-221-3p=342.916，PmiR-221-3p＜0.05)。
2.miR-221-3p介导电针治疗FD大鼠的机制研究
(1)FD大鼠模型的构建：观察到造模后大鼠体重下降，饮食量和饮水量减少；毛发枯乱发黄、掉毛；大便溏稀，且有较重的酸腐臭味；活跃程度减弱，抓捕反应迟钝，基本无攻击性和防御性；精神疲倦萎靡，状态不佳。对大鼠胃窦组织进行苏木素-伊红染色观察其形态结构未发现明显的器质性病变。
(2)miR-221-3p靶向调控c-kit基因，对c-kitmRNA表达的影响：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.001)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显高于空白对照＋空载组(P＜0.001)。电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显高于模型＋空载组(P＜0.05)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显低于模型＋空载组(P＜0.05)。与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显上升(P＜0.001)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显下降(P＜0.05)；与电针＋空载组比较，电针＋过表达组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显下降(P＜0.05)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显上升(P＜0.05)；差异均具有统计学意义。
(3)miR-221-3p介导电针对FD大鼠胃动力的影响：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃内残留率均明显高于空白对照＋空载组(P＜0.001)；电针＋空载组大鼠胃内残留率明显低于模型＋空载组(P＜0.001)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃内残留率明显下降(P＜0.001)，而电针＋过表达组大鼠胃内残留率明显上升(P＜0.001)，差异均具有统计学意义。
(4)各组大鼠胃窦组织内ICC数量的变化：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.001)；电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显高于模型＋空载组(P＜0.05)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显上升(P＜0.001)，而电针＋过表达组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显下降(P＜0.001)，差异均具有统计学意义。
(5)各组大鼠胃窦组织内ICC之间以及ICC与SMC之间缝隙连接蛋白CX43表达的变化：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.001)；电针＋空载组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达明显高于模型＋空载组(P＜0.001)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达明显升高(P＜0.001)，而电针＋过表达组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达明显下降(P＜0.001)，差异均具有统计学意义。
(6)各组大鼠胃窦组织SCF/c-kit和Raf/Erk信号通路相关蛋白表达的变化：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.05)；电针＋空载组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达明显高于模型＋空载组(P＜0.05)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达明显升高(P＜0.05)，而电针＋过表达组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达明显下降(P＜0.05)，差异均具有统计学意义。
结论
1.郭氏夹尾刺激法＋不规则饮食法＋冰生理盐水灌胃法的多因素应激干预法能够成功构建FD大鼠模型。
2.FD模型大鼠存在体重、饮食量和饮水量显著下降，胃排空延迟，胃窦组织内ICC的形态结构异常以及ICC的数量减少。
3.电针干预能够有效改善FD大鼠的一般行为学，减少胃内残留，增强胃动力，其可能机制为电针能够改善胃窦组织内ICC的形态结构，增加胃窦组织内ICC的数量。
4.电针干预FD大鼠前后差异性表达的miRNA总共有18种，其中只有miR-221-3p与c-kit基因(KIT)具有结合位点，并存在直接靶向关系。
5.miR-221-3p靶向调控c-kit基因(KIT)，能够负调节c-kitmRNA的表达。
6.干扰miR-221-3p抑制其靶向调控c-kit基因，能够上调c-kitmRNA的表达，通过激活SCF/c-kit和Raf/Erk信号通路，促进胃窦组织内ICC的增殖及缝隙连接蛋白CX43的表达，增强胃窦组织内ICC之间以及ICC、SMC之间的细胞间通讯，从而增强胃动力，在电针治疗FD过程中发挥作用。
本研究以患病率较高、影响较大、耗费卫生医疗资源较多的功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)为切入点，结合FD以胃动力障碍为主要病理生理基础的特点，以Cajal间质细胞(interstitial cell of Cajal，ICC)为胃慢波的起搏细胞和微小RNA(microRNA，miRNA)能够通过调控靶基因、靶信号通路途径调节细胞的增殖、分化、自噬等细胞效应为前提，探讨miRNA调控ICC在电针治疗FD大鼠改善其胃动力过程中的作用机制。
方法
采用SPF级健康成年雄性SD大鼠18只，适应性饲养1周后随机分为空白对照组(control group)、模型组(model group)、电针组(EA group)，每组6只。除空白对照组外，其他两组大鼠均予以多因素应激干预法构建FD模型，造模周期为14天。造模成功后，予以电针干预足三里穴和太冲穴，电针干预周期为10天。电针干预期间，观察各组大鼠的一般情况，并测量具体的体重、饮食量和饮水量。电针干预结束后，采用营养半固体糊对大鼠进行灌胃(2mL/100g)，30分钟后再予以戊巴比妥钠腹腔注射(5mg/100g)依次麻醉大鼠，麻醉成功后对大鼠进行解剖取材，称取每只大鼠的胃全重和胃净重，计算大鼠胃内残留率。将胃称重后，切取部分胃窦组织，采用苏木素-伊红染色观察各组大鼠胃窦组织形态结构；运用透射电镜观察各组大鼠胃窦组织内ICC的超微结构；采用免疫印迹法检测各组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平；运用miRNA测序筛查电针干预FD大鼠前后差异性表达的miRNA，并通过双荧光素酶报告基因检测验证差异性表达的miR-X与c-kit基因(KIT)之间的靶向关系；采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠胃窦组织c-kitmRNA和差异性miR-X的相对表达水平。
采用SPF级健康成年雄性SD大鼠30只，适应性饲养1周后随机分为空白对照＋空载组(control＋NC)、模型＋空载组(model＋NC)、电针＋空载组(EA＋NC)、电针＋干扰组(EA＋miR-Xinhibitor)，电针＋过表达组(EA＋miR-Xagomir)，每组6只。除空白对照组外，其他各组大鼠均予以多因素应激干预法构建FD模型，造模周期为14天。造模成功后，电针干预足三里穴和太冲穴，电针干预周期为10天；期间将构建的miR-X过表达和干扰载体，通过尾静脉注射途径注入相对应的各组大鼠。电针干预期间，观察各组大鼠的一般情况。电针干预结束后，采用同前方法计算大鼠胃内残留率。切取部分胃窦组织，采用苏木素-伊红染色观察各组大鼠胃窦组织形态结构；采用免疫印迹法检测各组大鼠胃窦组织CX43、SCF、c-kit、p-Raf/Raf、p-Erk/Erk蛋白的表达水平；采用实时荧光定量PCR检测各组大鼠胃窦组织CX43、SCF、c-kit、Raf、ErkmRNA和miR-X的相对表达水平。
结果
1.电针干预对FD大鼠的影响及电针干预前后差异性miRNA的筛查
(1)FD大鼠模型的构建：观察到造模后大鼠体重下降，饮食量和饮水量减少；毛发枯乱发黄、掉毛；大便溏稀，且有较重的酸腐臭味；活跃程度减弱，抓捕反应迟钝，基本无攻击性和防御性；精神疲倦萎靡，状态不佳。对大鼠胃窦组织进行苏木素-伊红染色观察其形态结构未发现明显的器质性病变。
(2)电针对FD大鼠一般行为学的影响：在造模前(0d)，三组间大鼠体重、饮食量、饮水量差异均无统计学意义(P＞0.05)。造模结束后(14d)，模型组和电针组大鼠体重、饮食量、饮水量均下降，两组间差异均无统计学意义(P＞0.05)；模型组、电针组大鼠体重、饮食量、饮水量分别与空白对照组相比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。经过10天的电针干预后(24d)，电针组和空白对照组大鼠体重、饮食量、饮水量显著增长，模型组大鼠体重、饮食量、饮水量也出现增加，但三组间比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
(3)电针对FD大鼠胃动力的影响：模型组和电针组大鼠胃内残留率明显高于空白对照组，而电针组大鼠胃内残留率明显低于模型组，三组间比较，差异均具有统计学意义(F=185.637，P＜0.001)。
(4)电针对FD大鼠胃窦组织ICC的影响：透射电镜下观察可见空白对照组ICC呈纺锤形或不规则多边形，细胞核较大呈卵圆形，核周边缘呈异染色致密带，细胞质较少，胞质内有丰富的线粒体等细胞器，自噬体少见。模型组ICC超微结构受到破坏，细胞核较大，细胞质内细胞器明显减少，可见明显的自噬体。电针组ICC呈纺锤形或不规则多边形，细胞核较大，细胞质内细胞器较多，线粒体肿胀不明显，自噬体结构不明显。通过免疫印迹法检测发现，模型组和电针组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显低于空白对照组，而电针组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显高于模型组，三组间比较，差异均具有统计学意义(F=556.283，P＜0.001)。
(5)电针干预FD大鼠前后差异性表达的miRNA筛查：总共有18种，其中下调miRNA有13种，上调miRNA有5种；通过Ensembl数据库和TargetScan数据库分析发现，差异性表达的18种miRNA中只有miR-221-3p与c-kit基因(KIT)的3’UTR存在互补位点。
(6)miR-221-3p和c-kit基因的靶向关系验证：转染c-kit3’UTR野生型(WT)载体质粒组，miR-221-3pmimic组的荧光素酶活性明显受到抑制，与miR-221-3pnc组相比，组间差异具有统计学意义(t=24.595，P＜0.001)；转染c-kit3’UTR突变型(MUT)载体质粒组，miR-221-3pnc组与miR-221-3pmimic组的荧光素酶活性比值相比较，差异无统计学意义(t=-0.254，P＞0.05)。模型组和电针组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显低于空白对照组，但大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显高于空白对照组。电针组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显高于模型组，但大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显低于模型组。三组间比较，差异均具有统计学意义(Fc-kitmRNA=285.762，Pc-kitmRNA＜0.05；FmiR-221-3p=342.916，PmiR-221-3p＜0.05)。
2.miR-221-3p介导电针治疗FD大鼠的机制研究
(1)FD大鼠模型的构建：观察到造模后大鼠体重下降，饮食量和饮水量减少；毛发枯乱发黄、掉毛；大便溏稀，且有较重的酸腐臭味；活跃程度减弱，抓捕反应迟钝，基本无攻击性和防御性；精神疲倦萎靡，状态不佳。对大鼠胃窦组织进行苏木素-伊红染色观察其形态结构未发现明显的器质性病变。
(2)miR-221-3p靶向调控c-kit基因，对c-kitmRNA表达的影响：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.001)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显高于空白对照＋空载组(P＜0.001)。电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显高于模型＋空载组(P＜0.05)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显低于模型＋空载组(P＜0.05)。与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显上升(P＜0.001)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显下降(P＜0.05)；与电针＋空载组比较，电针＋过表达组大鼠胃窦组织c-kitmRNA的表达水平明显下降(P＜0.05)，而大鼠胃窦组织miR-221-3p的表达水平明显上升(P＜0.05)；差异均具有统计学意义。
(3)miR-221-3p介导电针对FD大鼠胃动力的影响：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃内残留率均明显高于空白对照＋空载组(P＜0.001)；电针＋空载组大鼠胃内残留率明显低于模型＋空载组(P＜0.001)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃内残留率明显下降(P＜0.001)，而电针＋过表达组大鼠胃内残留率明显上升(P＜0.001)，差异均具有统计学意义。
(4)各组大鼠胃窦组织内ICC数量的变化：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.001)；电针＋空载组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显高于模型＋空载组(P＜0.05)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显上升(P＜0.001)，而电针＋过表达组大鼠胃窦组织c-kit蛋白的表达水平明显下降(P＜0.001)，差异均具有统计学意义。
(5)各组大鼠胃窦组织内ICC之间以及ICC与SMC之间缝隙连接蛋白CX43表达的变化：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.001)；电针＋空载组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达明显高于模型＋空载组(P＜0.001)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达明显升高(P＜0.001)，而电针＋过表达组大鼠胃窦组织CX43在蛋白和mRNA水平上的表达明显下降(P＜0.001)，差异均具有统计学意义。
(6)各组大鼠胃窦组织SCF/c-kit和Raf/Erk信号通路相关蛋白表达的变化：模型＋空载组、电针＋空载组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达均明显低于空白对照＋空载组(P＜0.05)；电针＋空载组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达明显高于模型＋空载组(P＜0.05)；与电针＋空载组相比较，电针＋干扰组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达明显升高(P＜0.05)，而电针＋过表达组大鼠胃窦组织SCF、c-kit、Raf、Erk在蛋白和mRNA水平上的表达明显下降(P＜0.05)，差异均具有统计学意义。
结论
1.郭氏夹尾刺激法＋不规则饮食法＋冰生理盐水灌胃法的多因素应激干预法能够成功构建FD大鼠模型。
2.FD模型大鼠存在体重、饮食量和饮水量显著下降，胃排空延迟，胃窦组织内ICC的形态结构异常以及ICC的数量减少。
3.电针干预能够有效改善FD大鼠的一般行为学，减少胃内残留，增强胃动力，其可能机制为电针能够改善胃窦组织内ICC的形态结构，增加胃窦组织内ICC的数量。
4.电针干预FD大鼠前后差异性表达的miRNA总共有18种，其中只有miR-221-3p与c-kit基因(KIT)具有结合位点，并存在直接靶向关系。
5.miR-221-3p靶向调控c-kit基因(KIT)，能够负调节c-kitmRNA的表达。
6.干扰miR-221-3p抑制其靶向调控c-kit基因，能够上调c-kitmRNA的表达，通过激活SCF/c-kit和Raf/Erk信号通路，促进胃窦组织内ICC的增殖及缝隙连接蛋白CX43的表达，增强胃窦组织内ICC之间以及ICC、SMC之间的细胞间通讯，从而增强胃动力，在电针治疗FD过程中发挥作用。