论文部分内容阅读
随着高通量测序技术的广泛应用，肌肉组织中大量环状RNA(circRNAs)被发现。已有报道circRNA-FUT10、circRNA-WDR77、circ-ZNF609与肌肉的生长发育密切相关。作为目前研究最为深入的环状RNA，CDR1as可竞争性结合miR-7调控靶基因IGF1R和Sp1的表达。同时发现CDR1as促进山羊骨骼肌卫星细胞的分化。此外，生肌决定因子MyoD是肌卫星细胞活化的标志物，可以调控肌肉特异性基因的表达促进成肌分化，并且在全基因组范围内具有广泛的调控作用。故推测，在肌细胞分化过程中，MyoD可能直接或间接地调控肌肉相关的circRNAs表达，但迄今为止尚未见报道。因此，本研究旨在探讨MyoD对CDR1as基因表达的调控作用及其机制。具体结果如下:
1.利用RT-qPCR分析了CDR1as及MyoD基因在胎儿期120d母山羊的不同肌肉组织及SMSCs分化过程中的表达模式;发现CDR1as在腓肠肌中表达最高，其次为背最长肌，半腱肌中最低。而与MyoD、MyHC和MyoG mRNA的表达变化趋于一致。此外，CDR1as与MyoD基因在SMSCs分化过程中均呈先上升后下降的趋势。这些结果提示肌肉组织和细胞中CDR1as的表达与MyoD相关。
2.在山羊SMSCs中，过表达MyoD促进SMSCs分化形成肌管，上调分化相关基因MyoG、MyHC和Myomaker的表达（P＜0.01），同时CDR1as的表达量也极显著增加(P＜0.01)。此外，增殖标志基因PCNA的表达亦极显著增加（P＜0.01）。相反，干扰MyoD后，抑制SMSCs的分化，下调肌肉发育相关基因的表达，CDR1as的表达也显著下调（P＜0.05）。上述结果暗示CDR1as的表达受到MyoD调控。
3.利用生物信息学软件分析，发现山羊CDR1as5调控区域（大约～1.9kb）与人CDR1as启动子区域相似性达60％，含有真核启动子典型的调控元件CAAT-box和TATA-box，并包含MyoD在内的多个与肌肉发育相关的转录因子结合位点。同时预测发现核心启动子序列在该片段的1294～1344区间，包含转录起始位点。
4.利用CDR1as启动子区域构建6个缺失载体(CP1～CP6)，分别转染到C2C12细胞中，诱导分化48h后进行双荧光素酶报告系统检测。结果显示，CP5缺失载体的转录活性显著高于其他载体，且含有MyoD的结合位点。进一步地，将CP5野生型载体（CP5-WT）与pEGFP-MyoD或si-MyoD共转染到C2C12细胞中，发现过表达MyoD极显著提高了CP5-WT的转录活性(P＜0.01)。相反，干扰MyoD显著抑制CP5-WT的转录活性(P＜0.05)。在HeLa细胞中同样发现过表达MyoD极显著提高CP5-WT的转录活性（P＜0.01），干扰则无明显改变。突变MyoD的结合位点后(CP5-Mut)，在C2C12和HeLa细胞中，CP5-Mut的转录活性均不受MyoD影响。此外，利用ChIP-PCR发现MyoD蛋白能够结合到CDR1as启动子上，过表达MyoD则增强与CDR1as启动子的结合。这些结果验证了CDR1as的转录受MyoD调控。
5.在放线菌素D处理的状态下，过表达CDR1as延长了MyoD mRNA的半衰期，说明CDR1as可以增强细胞质中MyoD mRNA的稳定性。同时利用在线软件分析发现CDR1as与MyoD mRNA具有直接结合能力。FISH试验验证在SMSCs增殖和分化阶段，CDR1as和MyoD mRNA在细胞质中共定位。综上，CDR1as可能通过与MyoD mRNA结合进而影响其稳定性。
总之，在山羊肌肉组织和细胞中，CDR1as的表达与MyoD相关。在细胞核中，MyoD可作用于CDR1as基因的启动子区域促进CDR1as的表达。此外，在细胞质中CDR1as则可能通过与MyoD mRNA结合以增强其稳定性。以上结果揭示了MyoD与circRNA CDR1as之间的相互调控机制，对进一步深入研究肌肉组织中circRNAs的功能具有重要的参考意义。
1.利用RT-qPCR分析了CDR1as及MyoD基因在胎儿期120d母山羊的不同肌肉组织及SMSCs分化过程中的表达模式;发现CDR1as在腓肠肌中表达最高，其次为背最长肌，半腱肌中最低。而与MyoD、MyHC和MyoG mRNA的表达变化趋于一致。此外，CDR1as与MyoD基因在SMSCs分化过程中均呈先上升后下降的趋势。这些结果提示肌肉组织和细胞中CDR1as的表达与MyoD相关。
2.在山羊SMSCs中，过表达MyoD促进SMSCs分化形成肌管，上调分化相关基因MyoG、MyHC和Myomaker的表达（P＜0.01），同时CDR1as的表达量也极显著增加(P＜0.01)。此外，增殖标志基因PCNA的表达亦极显著增加（P＜0.01）。相反，干扰MyoD后，抑制SMSCs的分化，下调肌肉发育相关基因的表达，CDR1as的表达也显著下调（P＜0.05）。上述结果暗示CDR1as的表达受到MyoD调控。
3.利用生物信息学软件分析，发现山羊CDR1as5调控区域（大约～1.9kb）与人CDR1as启动子区域相似性达60％，含有真核启动子典型的调控元件CAAT-box和TATA-box，并包含MyoD在内的多个与肌肉发育相关的转录因子结合位点。同时预测发现核心启动子序列在该片段的1294～1344区间，包含转录起始位点。
4.利用CDR1as启动子区域构建6个缺失载体(CP1～CP6)，分别转染到C2C12细胞中，诱导分化48h后进行双荧光素酶报告系统检测。结果显示，CP5缺失载体的转录活性显著高于其他载体，且含有MyoD的结合位点。进一步地，将CP5野生型载体（CP5-WT）与pEGFP-MyoD或si-MyoD共转染到C2C12细胞中，发现过表达MyoD极显著提高了CP5-WT的转录活性(P＜0.01)。相反，干扰MyoD显著抑制CP5-WT的转录活性(P＜0.05)。在HeLa细胞中同样发现过表达MyoD极显著提高CP5-WT的转录活性（P＜0.01），干扰则无明显改变。突变MyoD的结合位点后(CP5-Mut)，在C2C12和HeLa细胞中，CP5-Mut的转录活性均不受MyoD影响。此外，利用ChIP-PCR发现MyoD蛋白能够结合到CDR1as启动子上，过表达MyoD则增强与CDR1as启动子的结合。这些结果验证了CDR1as的转录受MyoD调控。
5.在放线菌素D处理的状态下，过表达CDR1as延长了MyoD mRNA的半衰期，说明CDR1as可以增强细胞质中MyoD mRNA的稳定性。同时利用在线软件分析发现CDR1as与MyoD mRNA具有直接结合能力。FISH试验验证在SMSCs增殖和分化阶段，CDR1as和MyoD mRNA在细胞质中共定位。综上，CDR1as可能通过与MyoD mRNA结合进而影响其稳定性。
总之，在山羊肌肉组织和细胞中，CDR1as的表达与MyoD相关。在细胞核中，MyoD可作用于CDR1as基因的启动子区域促进CDR1as的表达。此外，在细胞质中CDR1as则可能通过与MyoD mRNA结合以增强其稳定性。以上结果揭示了MyoD与circRNA CDR1as之间的相互调控机制，对进一步深入研究肌肉组织中circRNAs的功能具有重要的参考意义。