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研究背景和目的:急性白血病（AL）是当今严重威胁人类健康的恶性疾病，其发病率呈逐年上升的趋势，传统的治疗方法包括化疗、大剂量化疗及造血干细胞移植。近年来，异基因造血干细胞移植的开展，使该疾病的治愈率明显提高。该方法的本质实际上是在患者体内建立新的免疫平台，对残留白血病细胞进行免疫清除。因此，可以认为异基因造血干细胞移植在一定意义上属于免疫治疗的范畴。然而，仍有部分患者基于各种原因，如年龄、经济条件及无合适供者等，无法接受异基因造血干细胞移植，最终出现复发死亡，也有一些患者尽管接受了异基因造血干细胞移植，最终仍复发死亡。 调节性免疫细胞（cell）是一种具有广谱免疫抑制特征的细胞群，其中最为重要的是FOXP3+ CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）。根据其发育来源的不同，Treg可分为两类，分别是自然调节性Treg（nTreg）和诱导性Treg（iTreg）。大量研究提示，急性白血病患者中调节性T细胞的数量增加，而且与白血病细胞原发耐药有关。在多发性骨髓瘤患者使用沙利度胺治疗，发现下调骨髓瘤患者的Treg细胞可能是沙利度胺治疗多发性骨髓瘤有效的机制之一。本课题组在前期使用CIK细胞治疗非小细胞肺癌患者发现，CIK细胞能明显下调Treg细胞，且延长患者OS及PFS。 综合上述我们推测：免疫抑制微环境可能是急性白血病患者发病、耐药、复发的重要原因。因此，在本研究中，我们以AL患者为研究对象，动态观察其免疫细胞亚群及相关细胞因子的水平与疾病状态及临床特征的关系。进一步通过自体 CIK细胞联合沙利度胺对非移植患者进行化疗后维持治疗，观察其对免疫亚群的影响及其临床转归。并以异基因造血干细胞移植患者为对象，通过供者CIK细胞联合沙利度胺对异基因造血干细胞移植患者进行移植后预防治疗及复发后治疗观察，评价其疗效及安全性。 研究内容和方法: 第一部分急性白血病患者 T细胞亚群、细胞因子表达谱及其与临床特征的关系 收集103例AL患者以及28例健康体检者血浆和单个核细胞，用流式细胞仪检测观察 CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+CD25+Foxp3+细胞亚群比例变化；并用液相芯片方法检测血浆中细胞因子IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α，IFN-γ，TGF-β， IP-10,IL-15,IL-17和GMCSF的水平。比较分析T细胞亚群及细胞因子表达谱与患者临床特征的关系。 第二部分沙利度胺对HL60细胞株的体外抑制效应及在急性白血病患者维持治疗中的应用 体外培养HL60细胞株，观察不同浓度沙利度胺（25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml）对HL60的抑制作用。 收集20例行沙利度胺维持治疗前及治疗3个月后的AL患者的外周血，进行流式细胞学检测T细胞亚群比例；液相芯片方法检测血浆中细胞因子表达谱变化。比较分析口服沙利度胺前后免疫功能的变化及疗效评价。 第三部分急性白血病非造血干细胞移植患者应用自体CIK细胞联合沙利度胺维持治疗的临床观察 体外培养急性白血病患者CIK细胞，分别使用CIK细胞及沙利度胺联合CIK细胞对HL60细胞株进行体外杀伤试验，观察其杀伤效果。 临床研究分4组进行，所有入组急性白血病患者均经常规诱导、巩固化疗后，接受沙利度胺+CIK免疫治疗（A组）；或接受单独CIK治疗（B组）；或单独接受沙利度胺维持治疗（C组）；或不接受二者治疗（D组）。检测CIK输注前后患者T细胞亚群及细胞因子表达谱变化。比较4组患者PFS及OS。 第四部分供者CIK细胞联合沙利度胺在急性白血病异基因造血干细胞移植术后患者的应用及疗效分析 观察分析17例异基因造血干细胞移植患者移植前与移植后T细胞亚群及细胞因子表达谱，观察该治疗措施对免疫功能的影响 预防组：3例急性白血病患者异基因造血干细胞移植术后行供者CIK免疫治疗1-3次，同时联合沙利度胺100mg-200mg/d免疫调节治疗。治疗组：3例急性白血病患者异基因造血干细胞移植术后复发，采用 CIK联合沙利度胺100mg-200mg/d治疗。检测2组患者治疗前后T细胞亚群及细胞因子表达谱的变化，观察 GVHD临床表现及血沉、C反应蛋白、免疫球蛋白变化，评价其安全性及临床疗效。分别探讨比较异基因造血干细胞移植术后预防性（n=3）和复发后（n=3）采纳CIK联合沙利度胺治疗的临床转归。 结果: 第一部分急性白血病患者T细胞亚群、细胞因子表达谱及其与临床特征的关系 T细胞亚群与临床资料关系的分析：骨髓原始细胞大于50％的患者， CD3阳性T细胞水平明显低于原始细胞小于50%的患者，而Treg的比例却无显示不同。白血病细胞CD34阳性患者，其Treg明显高于CD34阴性患者，具有统计学差异；对比低、中和高危3组患者预后与免疫细胞的关系发现，高危组Treg细胞较低危组明显升高，具有统计学差异。18例患者通过连续监测细胞免疫动态发现Treg细胞前3个疗程化疗过程逐渐升高，到第4疗程逐渐下降，至第6疗程逐渐接近正常值，且与患者临床疗效相关。急性白血病患者总体 Treg水平明显高于健康对照者，而且在起病、复发时明显高于完全缓解期（持续缓解6个月以上），具有统计学差异。比较不同疾病类型其细胞免疫的变化发现急性髓细胞白血病Treg细胞上调比急性淋巴细胞白血病更加明显，具有统计学差异。 原始细胞大于50%的患者其TGF-β和IL-10水平明显高于原始细胞小于50%的患者，而IL-21则显著低于原始细胞小于50%者；CD34阳性的患者TGF-β较CD34阴性患者明显升高，中高危组TGF-β浓度显著高于低危组，具有统计学差异，对比不同疾病状态发现TGFβ、IL-10、IL-4、IL-6在起病、复发时明显升高，而IFN-γ、TNF-α、GMCSF、IL-21则明显下降；动态检测18例患者发现前3个疗程TGFβ、IL-10、IL-6水平逐渐下降，而IFN-γ、TNF-α则逐渐上升，具有统计学差异。 首疗程化疗完全缓解（CR）组Treg细胞比例、TGF-β含量以及TGF-β/IFN-γ比例明显低于非CR组，具有统计学差异。调节性T细胞大于10%的患者，首疗程完全缓解率68.9%。调节性T细胞小于10%为85.7%。随访发现高调节性T细胞组复发率20%，低调节性T细胞组复发率为7.69%，对比6例复发患者与32例持续CR患者的Treg比例、Treg/CD4及TGF-β/IFN-γ比值发现，复发组Treg比例、Treg/CD4及TGF-β/IFN-γ比值明显高于完全缓解组及对照组。 第二部分沙利度胺对HL60细胞株的体外抑制效应及在急性白血病患者维持治疗中的应用 体外实验显示沙利度胺对 HL60肿瘤细胞株具有浓度与时间依赖的抑制效应。临床治疗观察发现，口服沙利度胺3个月后调节性T细胞及Treg/CD4比值较口服治疗前下降，伴有TGF-β及IL-6同步减少。沙利度胺主要副作用是血栓、中性粒细胞轻度下降、便秘、嗜睡及手脚麻木，经处理后可缓解，不影响生活质量。随访发现沙利度胺组复发率21.05%，同期对照组为35%。生存分析显示沙利度胺组2年PFS率69.5%，对照组为54.7%，沙利度胺组2年OS率67.3%，对照组为55.6%，无统计学差异。 第三部分急性白血病非造血干细胞移植患者应用自体 CIK细胞联合沙利度胺维持治疗的临床观察 观察24h、48h、72h3个时间点不同CIK效靶比（5：1，10：1，20：1）对HL60的杀伤效果，结果显示随着时间的延长，杀伤效应逐渐增强，无论在24h、48h、72h，效靶比越高，杀伤效率越明显。沙利度胺25ug/ml联合不同CIK效靶比（5：1，10：1，20：1）对HL60的24h、48h、72h3个时间点杀伤实验，结果显示不同CIK效靶比联合沙利度胺对HL60细胞的抑制率优于单药或单独CIK组，具有统计学差异。 临床观察发现，A组患者外周血Tregs、MDSC在CIK细胞治疗后2周下降，4周时仍保持稳定的水平，同步可见NK细胞表面受体在治疗后表达增加， NK细胞比例明显上升；B组结果与A组相似。A组输注CIK细胞后，IFN-γ、IP-10、TNF-α、GMCSF、IL-21在2周时升高，4周时渐回落至基态水平；TGF-β及IL-6水平在CIK细胞治疗后2周时降低，4周时TGF-β和IL-6水平与治疗前无统计学差异；B组除IL-6无明显差异外，其他细胞因子表达与A组相似。随访比较4组患者的复发率、死亡率、PFS及 OS显示：沙利度胺联合 CIK组PFS明显较对照组有改善，两组差异有统计学意义。 第四部分供者CIK细胞联合沙利度胺在急性白血病异基因造血干细胞移植术后患者中的应用及疗效分析 对比异基因造血干细胞移植患者前后免疫细胞变化发现,移植后1月患者Treg细胞明显下降，3月后逐渐恢复，对比不同供者来源移植发现，非血缘移植及半相合异基因造血干细胞移植患者 Treg细胞下降趋势更加明显，其中非血缘移植后 Treg细胞数量比全相合移植下降差异具有统计学意义。对比异基因造血干细胞移植患者移植前及移植后1、3个月细胞因子表达谱发现,移植后1月患者TGFβ，IL-10明显下降，IP-10、TNFα、IFNγ、GMCSF较前明显升高，移植后3月，TGFβ，IL-10逐渐上升，IP-10、IFNγ、GMCSF逐渐下降，TNFα下降并不明显，与移植前相比差异仍然有统计学意义。 在预防性或移植后复发治疗观察发现，2组供者CIK输注后Treg、MDSC均较输注前下降； NK细胞表面活化性受体NKG2D表达增加。NK细胞比例在输注后4周明显升高，差异有统计学意义。无论预防组还是治疗组：IFN-γ、IP-10、TNF-α、GMCSF在CIK细胞治疗后2周时均升高，至CIK细胞治疗后4周时渐回落至基态水平；TGF-β水平则在治疗后下降，与治疗前相比下降差异有统计学意义。治疗组1例M2患者CIK治疗2天后血涂片发现白血病细胞比例下降48%，1例M1患者CIK治疗2天后血涂片发现白血病细胞比例下降21%，1例急性B淋巴细胞白血病患者，髓外复发（乳腺浸润），CIK治疗前后PET/CT提示肿块明显缩小。6例患者均无GVHD发生，IG-G及ESR输注CIK后明显上升。预防组3例有1例在9个月后出现髓外复发，1例在11个月后出现髓外复发。1例持续缓解状态，OS达36个月。治疗组1例在治疗后2个月死亡，1例在3个月死亡，1例达PR，骨髓持续缓解8个月。通过生存分析发现，对高危急性白血病患者，若无GVHD发生，移植后使用CIK联合沙利度胺预防治疗在OS方面优于未行预防性治疗患者；对复发的患者，采纳供者 CIK联合沙利度胺治疗较之其他治疗能获得更好的生存质量及更长的无病生存期。 结论: 1、外周血调节性T细胞水平及相关细胞因子表达的动态变化与急性白血病患者的临床特征、复发及预后等密切相关。 2、对急性白血病非移植患者进行沙利度胺联合CIK细胞维持治疗，具有协同克服免疫抑制微环境，下调调节性T细胞分化扩增；激活非MHC依赖的NK细胞杀伤肿瘤细胞的活力，提高患者的PFS。 3、在异基因造血干细胞移植术后，对无明显GVHD的高危患者，采用沙利度胺联合供者CIK细胞进行预防治疗，可以诱导GVL效应而无GVHD发生。