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目的：聚乙二醇修饰（PEGylation）是指通过某种化学反应将大分子聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）以共价键的形式结合到蛋白质表面氨基酸残基，以达到保护蛋白质表面不发生蛋白水解降解和蛋白聚集，从而提高功能蛋白质的药代动力学和体内稳定性。然而，目前的聚乙二醇修饰方法通常会由于大分子聚乙二醇的空间位阻效应阻碍其与靶点的结合，从而导致聚乙二醇化产物的生物学活性显著降低。从根本上来说，这是由于没有基于蛋白结构来选择保持最佳的聚乙二醇修饰位点。在本研究中，我们基于FGF2-FGFR1-肝素复合物结构选择性的进行了位点特异性聚乙二醇修饰，并结合结构表征、细胞活性和蛋白质功能的分析，以该蛋白为模型蛋白阐述聚乙二醇修饰位点选择的原则和方法，为蛋白类药物的聚乙二醇修饰提供一定的理论指导。
方法：（1）FGF2突变体的设计与制备：通过分析FGF2-FGFR-肝素三元复合物的晶体结构在FGF2的表面选择四个典型的氨基酸作为聚乙二醇修饰位点，即将野生型FGF2蛋白表面的半胱氨酸用丝氨酸取代得到FGF2C78S/C96S，后引入单一半胱氨酸得到FGF227C（受体结合区）、FGF278C（远离结合区位点）、FGF296C（远离结合区位点）和FGF2129C（肝素结合区）；将表达载体转化到BL21（DE3）感受态细胞中，置于添加有氨苄霉素的LB培养基中37℃、200rpm摇床培养，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达4小时，变性凝胶电泳（SDS-PAGE）验证蛋白是否成功表达。收集菌体并采用超声波破碎，细菌悬液在4℃下12000rpm离心30min，收集上清液，利用FGF2与肝素的特异性亲和力，经肝素结合色谱柱结合，Superdex7510/300凝胶层析色谱柱分析纯化并利用SDS-PAGE鉴定。（2）聚乙二醇化FGF2突变体的制备和分离纯化：将单氧基聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-MAL）与FGF2突变体特定摩尔比混合，于4℃下反应1小时，SDS-PAGE电泳确认PEG修饰效率，再经肝素亲和色谱柱纯化除去未修饰结合的mPEG-MAL，最后利用圆二色谱和飞行质谱对PEG化蛋白的二级结构和分子量进行表征。（3）对比FGF2突变体在聚乙二醇修饰前后肝素或受体结合能力的差异：通过表面离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术对比FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体与受体FGFR及肝素的亲和能力。（4）促细胞增殖活性的对比：采用MTT法分析FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体对NIH-3T3细胞系的促增殖活性以及激活下游信号强度的差异。（5）蛋白抗酶解力的分析：采用SDS-PAGE结合蛋白酶解实验测定FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体抗酶解力差异。（6）体内稳定性评估：在SD大鼠中尾静脉注射FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体，不同时间点取血后通过酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定药代动力学曲线和药代动力学参数。（7）对外伤性脑损伤（Traumatic brain injuries，TBI）所致神经功能缺损的保护作用评价：设置小鼠创伤性脑损伤TBI模型，通过小鼠行为学测定、伊文思蓝染色和脑部切片染色，比较FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2各突变体对TBI小鼠模型的保护作用。
结果：通过蛋白质制备以及包括圆二色谱和质谱在内的蛋白结构分析可以确定成功制备了FGF2突变体以及相应的PEG化产物；表面等离子共振的分析数据显示，与结构分析相吻合，在FGF2的受体或者肝素结合位点实施聚乙二醇修饰确实显著影响其与FGFR1或肝素的结合能力；促细胞增殖实验和下游信号的激活数据证实在受体或者肝素结合位点实施修饰所得PEG-FGF227C和PEG-FGF2129C的促细胞增殖活性和激活下游信号的能力显著降低而另外两个PEG化FGF2改构体活性基本保留；体外酶解实验和体内药代动力学实验均证实PEG修饰能够增加蛋白的抗酶解能力和提高蛋白的体内稳定性，且这一能力与PEG修饰位点无显著相关性；TBI小鼠的神经保护实验进一步证实了，在远离受体和肝素结合区修饰的的PEG-FGF278C和PEG-FGF296C比FGF2C78S/C96S表现出更好的体内稳定性和对脑部神经的保护作用。
结论：对这些数据综合分析表明，以FGF2-FGFR1-肝素复合物结构为基础，在FGF2远离受体FGFR1和肝素结合区域的位点进行PEG修饰，PEG化后的蛋白能够在提高蛋白稳定性的同时保留其生物学活性。这种基于蛋白结构的理性聚乙二醇修饰方法有望在蛋白质药物的治疗领域产生重大影响，解决目前聚乙二醇修饰策略所面临的关键问题。
方法：（1）FGF2突变体的设计与制备：通过分析FGF2-FGFR-肝素三元复合物的晶体结构在FGF2的表面选择四个典型的氨基酸作为聚乙二醇修饰位点，即将野生型FGF2蛋白表面的半胱氨酸用丝氨酸取代得到FGF2C78S/C96S，后引入单一半胱氨酸得到FGF227C（受体结合区）、FGF278C（远离结合区位点）、FGF296C（远离结合区位点）和FGF2129C（肝素结合区）；将表达载体转化到BL21（DE3）感受态细胞中，置于添加有氨苄霉素的LB培养基中37℃、200rpm摇床培养，加入1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达4小时，变性凝胶电泳（SDS-PAGE）验证蛋白是否成功表达。收集菌体并采用超声波破碎，细菌悬液在4℃下12000rpm离心30min，收集上清液，利用FGF2与肝素的特异性亲和力，经肝素结合色谱柱结合，Superdex7510/300凝胶层析色谱柱分析纯化并利用SDS-PAGE鉴定。（2）聚乙二醇化FGF2突变体的制备和分离纯化：将单氧基聚乙二醇马来酰亚胺（mPEG-MAL）与FGF2突变体特定摩尔比混合，于4℃下反应1小时，SDS-PAGE电泳确认PEG修饰效率，再经肝素亲和色谱柱纯化除去未修饰结合的mPEG-MAL，最后利用圆二色谱和飞行质谱对PEG化蛋白的二级结构和分子量进行表征。（3）对比FGF2突变体在聚乙二醇修饰前后肝素或受体结合能力的差异：通过表面离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术对比FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体与受体FGFR及肝素的亲和能力。（4）促细胞增殖活性的对比：采用MTT法分析FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体对NIH-3T3细胞系的促增殖活性以及激活下游信号强度的差异。（5）蛋白抗酶解力的分析：采用SDS-PAGE结合蛋白酶解实验测定FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体抗酶解力差异。（6）体内稳定性评估：在SD大鼠中尾静脉注射FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2突变体，不同时间点取血后通过酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定药代动力学曲线和药代动力学参数。（7）对外伤性脑损伤（Traumatic brain injuries，TBI）所致神经功能缺损的保护作用评价：设置小鼠创伤性脑损伤TBI模型，通过小鼠行为学测定、伊文思蓝染色和脑部切片染色，比较FGF2C78S/C96S和PEG化FGF2各突变体对TBI小鼠模型的保护作用。
结果：通过蛋白质制备以及包括圆二色谱和质谱在内的蛋白结构分析可以确定成功制备了FGF2突变体以及相应的PEG化产物；表面等离子共振的分析数据显示，与结构分析相吻合，在FGF2的受体或者肝素结合位点实施聚乙二醇修饰确实显著影响其与FGFR1或肝素的结合能力；促细胞增殖实验和下游信号的激活数据证实在受体或者肝素结合位点实施修饰所得PEG-FGF227C和PEG-FGF2129C的促细胞增殖活性和激活下游信号的能力显著降低而另外两个PEG化FGF2改构体活性基本保留；体外酶解实验和体内药代动力学实验均证实PEG修饰能够增加蛋白的抗酶解能力和提高蛋白的体内稳定性，且这一能力与PEG修饰位点无显著相关性；TBI小鼠的神经保护实验进一步证实了，在远离受体和肝素结合区修饰的的PEG-FGF278C和PEG-FGF296C比FGF2C78S/C96S表现出更好的体内稳定性和对脑部神经的保护作用。
结论：对这些数据综合分析表明，以FGF2-FGFR1-肝素复合物结构为基础，在FGF2远离受体FGFR1和肝素结合区域的位点进行PEG修饰，PEG化后的蛋白能够在提高蛋白稳定性的同时保留其生物学活性。这种基于蛋白结构的理性聚乙二醇修饰方法有望在蛋白质药物的治疗领域产生重大影响，解决目前聚乙二醇修饰策略所面临的关键问题。