【摘 要】
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目的:传统中医药在当前肿瘤治疗中具有重要地位。从中草药和天然药物中提取有效成分并探究其抗肿瘤的作用与机理已逐渐成为药理学研究的热点之一。从景天科中药红景天中提取
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目的:传统中医药在当前肿瘤治疗中具有重要地位。从中草药和天然药物中提取有效成分并探究其抗肿瘤的作用与机理已逐渐成为药理学研究的热点之一。从景天科中药红景天中提取的主要活性成分——红景天苷(Salidroside)具有多种药理活性,且无明显毒副作用,是具有广阔开发前景的天然活性产物。当前对红景天苷抗肝细胞癌活性的研究较少。本课题旨在研究红景天苷的体外抗肝癌作用,并初步探讨其可能的作用机理。方法:本论文对红景天苷对人肝癌细胞HepG2的增殖与凋亡的影响进行了研究。首先以噻唑蓝比色法和氚代胸腺嘧啶掺入实验检测红景天苷对HepG2细胞增殖的影响,以确定红景天苷作用的有效剂量为之后的机制研究提供参考。然后利用Hoechst染色及流式细胞术检测红景天苷对HepG2细胞凋亡的影响。进一步利用JC-1染色法检测药物作用的HepG2细胞的线粒体膜电位,Western blot法检线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2、Bax的表达、Cytochrome c从线粒体向胞浆的释放、及Caspase-9和Caspase-3的活性。最后以Western blot法检测红景天苷对HepG2细胞中p53基因表达的影响,以及在p53抑制剂Pifithrin-α作用下观察药物诱导凋亡的作用是否与激活p53相关。结果:(1)两种细胞增殖实验均显示红景天苷可以剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖,在60μM剂量下具有显著性抑制作用。(2)Hoechst染色实验显示红景天苷在20-60μM剂量范围内能够诱导HepG2细胞发生凋亡;流式细胞术显示红景天苷处理的HepG2细胞凋亡率显著增高,红景天苷在60μM剂量时凋亡率可达到42.3%。(3)红景天苷可以剂量依赖性地降低HepG2细胞的线粒体膜电位,上调促凋亡的Bax的蛋白表达,下调抗凋亡的Bcl-2的蛋白表达,并促进细胞色素c从线粒体释放进入胞浆。进一步对Caspase级联的检测发现,红景天苷能够显著增加HepG2细胞内活化型Caspase-9和活化型Caspase-3的含量。(4)对信号通路的检测结果表明,红景天苷能够剂量依赖性增加HepG2细胞内p53基因的蛋白表达;进一步使用p53特异性抑制剂皮斐松(Pifithrin-α,PFT-α)发现,抑制p53能够抵消红景天苷对抗凋亡的Bcl-2蛋白表达的抑制作用,同时削弱对促凋亡的Bax蛋白表达的上调作用;此外PFT-α还显著抵消了红景天苷对活化型caspase-3的上调作用。结论:本论文研究结果表明,红景天苷体外能够抑制人肝癌HepG2细胞的增殖并且能有效诱导其凋亡,该作用与上调p53蛋白进而激活线粒体凋亡途径及Caspase级联反应相关。这可能是红景天苷抗肿瘤作用的机理之一。本论文的研究为将红景天苷开发为高效低毒的抗肝癌药物提供实验依据。
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