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研究背景：
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，九十年代以来已成为我国第二位的癌症杀手，而且发病率呈逐年上升趋势。肝癌的组织学来源比较单一，肝细胞性肝癌(hepatocellular carcmoma，HCC)是最常见的组织学类型。HCC具有起病隐匿，侵袭性生长快速，恶性程度高，治疗后易复发，病死率高等特点，尽管治疗手段发展迅速，但肝癌五年生存率仍较低。加强肝癌病因学的研究成为人类目前与肝癌抗争的关键。肝癌相关基因的深入研究，对于阐明肝癌的发病机理，肝癌的早期诊断及开发出新的治疗手段，进而提高肝癌患者的生存率都具有重要的意义。
HCC的发生过程是多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。HCC的癌前病变中分子遗传学的改变主要包括肿瘤抑癌基因失活，癌基因的激活，其中抑癌基因失活在肝癌的发生发展中起到了至关重要的作用。抑癌基因失活的主要方式是缺失、突变和异常甲基化，在恶性肿瘤中等位基因杂合性缺失(Loss of Heterozygosity，LOH)的位点很可能就是抑癌基因的潜在区域，分析杂合性缺失已经成为目前检测肿瘤抑制基因失活和发现及定位新的肿瘤抑制基因的重要手段之一，而作为杂合性缺失分析的遗传标记也在不断的更新换代，分别经历了RFLP、 MS及最近的SNP。SNP在基因组中分布广泛，密度高，遗传稳定性好、具有代表性等特性，从而成为LOH检测的新的标记。因为是单个碱基的突变，非此即彼，与电脑二进制的程序相同，可以直接利用芯片技术高通量、快速的分析结果，SNP芯片技术已经在与人类疾病相关基因的研究中发挥着越来越重要的作用。利用SNP芯片技术检测肿瘤染色体的LOH，成为了寻找肿瘤相关抑癌基因的主要手段之一。国内外已有许多对HCC全基因组扫描或者染色体分析的研究，其中染色体4q在HCC中经常发生缺失，而在其它肿瘤中相对比较少见。前期研究中我们用382个微卫星标志对65例的人肝细胞癌进行了全基因组范围等位基因LOH的分析，发现4q杂合性缺失的频率高达48.1％，提示4q上存在肝癌相关的抑癌基因。本研究旨在前期研究的基础上，创新性的应用我们自己开发的SNP芯片技术针对整条4q进行扫描，以期筛查出肝癌相关的抑癌基因。
第一部分 SNP芯片技术分析肝细胞癌染色体4q杂合性缺失的初步研究
目的：在前期研究的基础上，创新性的应用我们自己开发的SNP芯片技术针对染色体4q进行扫描，分析SNP的杂合性缺失，并且探讨4q上LOH的SNP位点与肝癌临床病理参数，转移及复发的关系。
方法：选取了4q上40个具有代表性的SNP位点制成SNP芯片，利用SNP芯片技术对69例肝癌组织、5株肝癌细胞系及1株changliver进行LOH的分析，并且探讨LOH的SNP位点与肝癌临床病理参数，转移及复发的关系。
结果：69例肝癌中至少有1个位点出现杂合性缺失者51例，染色体4q的总杂合性缺失频率为73.9％，LOH发生频率最高的位点为rs2249916(47.0％)，位于4q35.2；其次为rs10013652(45.4％)，位于4q26。LOH＞30％的位点有9个(rs2298732、rs965012、rs10013652、rs1567475、rs1514479、rs2249916、rs7677254、rs10033674及rs1876442)。LOH发生频率较高的两个区域为4q24-26及4q34.3-35。rs1567475(4q34.3)位点的LOH与肝癌的病理分级相关(p＜0.05)，病理分化较差的肝癌表现出高频的LOH；rs7656234位点(4q13.3)与HBV感染相关(p＜0.05)；其余的SNP位点与年龄、性别、HBV感染、血清AFP、肿瘤大小、肝硬化及病理分级均无关(p＞0.05)。
结论：利用SNP芯片技术对4q上的40个SNP位点进行LOH分析，发现4q上存在两个高频缺失的区域(4q24-26及4q34.3-4q35)，而且rs1567475(4q34.3)位点的LOH与肝癌的病理分级相关，病理分化较差的肝癌表现出高频的LOH，提示在这两个区域可能存在与肝癌发生发展相关的抑癌基因。
第二部分 SNP芯片技术分析肝细胞癌染色体4q34.3-35区域基因的杂合性缺失
目的：在第一部分研究的基础上，应用SNP芯片技术检测高频缺失的4q34.3-4q35区域内的63个基因的杂合性缺失频率，筛选出缺失频率较高的基因。并且探讨高频缺失SNP位点与肝癌临床病理参数，转移及复发的关系。
方法：选取4q34.3-4q35内63个基因内部的338个具有代表性的SNP位点制成SNP芯片，利用SNP芯片技术对69例肝癌组织、5株肝癌细胞系及1株changliver进行LOH的分析，并且探讨LOH的SNP位点与肝癌临床病理参数，转移及复发的关系。
结果：肝癌中4q34-35.2区域的杂合性缺失频率为94.2％。LOH发生频率最高的位点为rs2048076(46.7％)，位于NEIL3基因内部，其次为rs6830958(41.2％)，位于ING2基因内部，另一个LOH频率不小于40％为rs10000856，在IRF2基因内部。LOH＞20％的位点有19个。其余SNP位点的LOH均小于20％，或者无杂合性缺失。在肝癌细胞系中，SNP的LOH均与changliver相比，结果显示ING2基因内部的rs6830958位点在两个肝癌细胞系中发生缺失，包括HepG2及SK-HEP-1，另外发现基因IRF2内部的rs10000856位点在HepG2与BEL7402细胞系中发生LOH。在所检测的高频LOH(＞20％)的SNP位点中，杂合性缺失与年龄、性别、HBV感染、血清AFP、肿瘤大小、肝硬化及病理分级均无关(p＞0.05)。
结论：对肝癌中高频杂合性缺失的4q34.3-4q35.2区域的63个基因设计了338个SNP位点，利用芯片技术检测基因的LOH，结果发现NEIL3(rs2048076)、ING2(rs6830958)及IRF2(rs2048076)有较高频率的LOH(≥40％)。ING2(rs6830958)及IRF2(rs2048076)在肝癌细胞系有较易发生LOH。
第三部分ING2基因在肝细胞癌中表达及临床意义的研究
在第一、二部分的研究中发现肝癌高频缺失区域4q34.3-4q35中的ING2基因内部的rs6830958为高频缺失位点。ING2基因作为生长抑制因子家族的主要成员，被认为是一个新的候选抑癌基因可以抑制细胞的生长，诱导凋亡及参与DNA修复，研究表明ING2与P53协同作用，发挥抑癌功能。
目的：本研究旨在探讨ING2基因在肝癌中的表达，并且分析其表达水平与临床参数的关系。
方法：收集了87例肝癌及正常对照组织，应用RT-PCR、western blot技术检测了ING2基因的表达水平；免疫组化技术检测了84例石蜡包埋组织ING2在肝癌中的表达水平，分析了它与临床参数的关系并且探讨与肝癌预后的关系。
结果：ING2在mRNA及蛋白水平相对与对照组织表达降低，有统计学意义(p＜0.05)。免疫组化技术检测了84例肝癌组织的ING2表达水平，其中44例ING2低表达(52.4％．)，而且ING2的表达与肿瘤大小，分化程度及AFP密切相关(p＜0.05)。生存分析显示ING2低表达患者生存时间较短(p=0.009)，多因素分析显示，ING2低表达是肝癌患者的一个独立的预后因素(p=0.041)。
结论：ING2基因在肝癌的发生发展中起重要作用，作为肝癌相关的候选抑癌基因，它的低表达导致患者不良的预后。