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石斛是一种常用贵重中药材,具有悠久的药用历史,因米源和加工方法的不同,一般分为金钗石斛、黄草石斛和枫斗等三类。铁皮石斛是石斛类药材中的珍贵品种一铁皮枫斗的唯一来源,目前市场上伪品很多。叠鞘石斛是黄草类石斛中的主流品种之一,市场上应用较多。为了建立一种快速、准确鉴别铁皮石斛和叠鞘石斛的方法,我们收集了市场上流通较多的26种石斛并对其中12种石斛的marK基因进行了序列测定,然后根据铁皮石斛、叠鞘石斛和其它石斛mark基因序列信息,分别设计了1对未突变的ARMS引物和1对突变的ARMS引物用于鉴别铁皮石斛和叠鞘石斛。结果显示使用未突变的引物不能实现两种石斛的专属性鉴别:使用突变的引物对(T-F3/T-R2)在57℃退火20 s时只有铁皮石斛的模板DNA可以扩增出一条484 bp的条带,其它石斛扩增结果均为阴性;使用突变的引物对(SH-P1/D-R3)在63℃退火25s时,只有叠鞘石斛样品可以扩增出一条771 bp的条带,其它石斛扩增结果均为阴性。实验证明应用设计的两对突变的ARMS引物可以快速、准确地鉴别铁皮石斛和叠鞘石斛。
金钗石斛是历版中国药典的收载种,野生资源目前已濒于灭绝。开展金钗石斛形态变异和遗传变异的研究对于其居群的保护、种质资源保存及良种选育等均具有重要的意义。本研究首先对来自7个省市20个居群的136个金钗石斛样本的表型性状进行了测量并加以分析,然后应用直接测序技术对20个居群样品的ITS区、psbA-trnH基因间隔区和trnL-trnF基因间隔区进行了序列测定和分析,最后对形态变异、遗传变异和地理分布进行了相关性分析。形态变异研究结果显示金钗石斛形态变异十分丰富,各表型性状变化范围较广,居群内和居群间存在显著的变异,且居群内变异小于居群间。遗传变异研究结果显示金钗石斛居群内比较稳定,居群间表现出一定的遗传分化,其中ITS区进化速率较快,psbA-trnH基因间隔区存在多个位点的插入或缺失,trnL-trnF基因间隔区进化速率最慢。相关性研究结果显示测量出的所有表型性状值(不包括计算出的形态系数)在我国西部靠近长江流域均比较高;遗传变异与地理分布也有一定的相关性,基于ITS区序列分成的2大类金钗石斛明显具有海拔上差异,其中一类分布于海拔较低地区,另一类则分布于海拔较高地区;遗传变异与形态变异的相关性没有明显规律。根据上述研究结果推测金钗石斛生长的微环境对其表型性状形成具有更大的作用力。
国产石斛资源紧缺,远远不能满足商品石斛原料的供应,急需发展新的石斛药用资源,因此我们对国内外资源比较丰富但未作药用的蝴蝶石斛栽培品进行了性状鉴别、显微鉴别和遗传稳定性分析。性状鉴别和显微鉴别结果显示蝴蝶石斛栽培品具有与石斛中的大黄草类石斛相似的特征。遗传稳定性分析研究结果显示蝴蝶石斛栽培品与石斛属其它种之间表现出一定的遗传分化,ITS区、matK基因和psbA-trnH基因间隔区序列两两比对后的核酸碱基差异百分率分别为9.5％-29.5％、1.6％-3.7％和1.4％-5.4％,而栽培于泰国、海南三亚和江苏等不同来源的蝴蝶石斛栽培品在遗传上表现出一定的稳定性,ITS区、marK基因和psbA-trnH基因间隔区序列两两比较后的核酸碱基差异百分率分别为0-9.5％、0-1.6％和0-0.3％。基于marK基因和psbA-trnH基因间隔区序列构建的系统树显示不同来源的蝴蝶石斛栽培品遗传分化很小,所有样本均聚在同一分支上。该研究结果表明,不同来源的蝴蝶石斛栽培品具有一定的遗传变异,且变异程度明显的小于与石斛属其他物种之间的差异,表现出明显的稳定性;原产地栽培品与引种栽培品之间也没有显著的差异,说明蝴蝶石斛栽培品在无性繁殖与引种栽培过程中,环境以及栽培代数对其遗传背景影响很小,以无性繁殖建立的蝴蝶石斛栽培品种植体系具有种质遗传上的稳定性,并且可以根据序列特征对其进行鉴别。结合我们石斛课题组对其指标性成分石斛酚的定性、定量结果,表明可以将蝴蝶石斛栽培品作为药用石斛的替代资源使用。