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禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)是一种引起禽免疫抑制和矮小综合征等代表性特征的C型禽逆转录病毒。该病毒感染造成禽类宿主免疫抑制后,使宿主易发生二次感染或/和混合感染,加重禽类疫病的程度,同时增加禽类疾病发病率和死亡率,给全球养禽业造成严重经济损失。最近有研究报道,REV对新的宿主具有潜在威胁,因此,研究REV的致病机制,特别是其免疫抑制机制尤为重要,在公共卫生学上也具有实际意义。树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前已知抗原提呈功能最强的免疫细胞,它是先天性免疫和后天获得性免疫的桥梁,在机体免疫应答中发挥重要作用。DC的类型不同,其功能也不完全相同,未成熟树突状细胞具有很强的抗原吞噬能力,吞噬抗原后细胞逐渐成熟;成熟的树突状细胞呈递抗原能力较强,因此具有很强的免疫激活能力,可激活T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞等。本研究以鸡骨髓源树突状细胞(chicken bone marrow derived dendritic cells,ch BM-DC)为对象,在成功建立REV感染ch BM-DCs模型的基础上,应用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞的形态变化,应用流式细胞术检测细胞表面标志,应用实时荧光定量PCR、间接ELISA方法,较全面系统对REV感染ch BM-DCs后,其Toll样受体(Tolllike receptors,TLR)介导的抗病毒天然免疫进行研究,主要结果如下:(1)通过形态观察发现,体外诱导培养的鸡骨髓源细胞具备DCs典型形态特点,通过检测细胞表面标志CD11c、MHCⅡ,鉴定诱导培养的ch BM-DCs具有较高纯度,结果表明,成功诱导出大量且高纯度的鸡骨髓源树突状细胞。(2)通过设计两因素四水平实验,优化细胞培养条件,在此条件下培养细胞,通过CCK-8法测定了细胞生长情况,并绘制了细胞生长曲线,结果表明,细胞生长状态良好。(3)通过PCR方法对病毒的感染进行鉴定,结果发现,在REV感染的ch BM-DCs中检测到REV的特异性LTR保守序列,而未感染REV的对照细胞中未扩增出该基因。表明成功建立REV感染ch BM-DCs模型。(4)通过检测正常组、LPS组和REV感染组DCs形态变化及表面标志表达情况,结果显示,相比LPS刺激组,REV感染组细胞表面突起较短,且MHCⅡ表达显著降低,表明REV对树突状细胞的成熟具有一定抑制作用。(5)REV感染ch BM-DCs后6h,细胞中TLR3、TLR7、TLR21、TRIF、My D88、NF-κB m RNA表达均极显著(P<0.01)高于对照细胞;病毒感染后12、24和48h,细胞中TLR3 m RNA表达极显著(P<0.01)低于对照细胞;TLR7、TLR21 m RNA表达于病毒感染后12和24h显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照细胞,于病毒感染后48和72h显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照细胞;TRIF m RNA表达于病毒感染后12和24h极显著(P<0.01)低于对照细胞,其他被检时间点未见统计学差异;My D88 m RNA表达于病毒感染后12h显著(P<0.05)低于对照细胞,48h显著(P<0.05)高于对照细胞,其他被检时间点未见统计学差异;NF-κB m RNA表达于病毒感染后24和48h显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照细胞。表明REV感染早期可以强烈引起TLR受体介导的先天性免疫反应,但随着病毒的不断复制,REV通过抑制TLRs及其相关因子的表达,从而逃避TLRs对其的识别。(6)REV感染ch BM-DCs后,细胞中IL-6 m RNA表达于病毒感染后6h极显著(P<0.01)高于对照细胞,IL-6蛋白含量于病毒感染后12和72h极显著(P<0.01)高于对照细胞;IFN-βm RNA表达及蛋白含量于病毒感染后6和12h显著或极显著(P<0.05 or P<0.01)高于对照细胞:IFN-β蛋白含量于病毒感染后24和48h均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照细胞,72h极显著(P<0.01)高于对照细胞;IL-8 m RNA表达及蛋白含量于病毒感染后6、12、24和48h明显(P<0.05或P<0.01)高于对照细胞,其他被检时间点未见统计学差异。表明REV在感染早期可以强烈引起ch BM-DCs的抗病毒反应和炎症反应,但随着病毒的不断复制,REV通过逃避TLRs对其的识别而抑制宿主细胞产生干扰素,从而促进其在宿主细胞内的存活及增殖。