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本研究从广东省湛江、广州和肇庆等地区水果园和蔬菜地采集土壤43份并分离获得放线菌212株。以荔枝霜疫霉病菌(Peronophypthora litchii)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)为靶标菌,采用平板对峙法和生长速率法相结合对其进行初步筛选和再次筛选,筛选获得6株具有拮抗活性的放线菌,其中放线菌MY-5拮抗活性最强,抑菌带分别宽达13.75 mm和11.00mm,菌丝生长抑制率为52.17％和48.22%。
对拮抗放线菌MY-5进行了形态学特征、培养特征、生理生化特征和分子生物学鉴定。形态学特征观察结果分析,该菌气生菌丝多分枝,孢子椭圆形,表面光滑,表明该菌株属于链霉菌属。分子鉴定结果表明,在以16SrDNA序列为基础构建的系统发育树中,拮抗放线菌MY-5与密旋链霉菌(Streptomyces pactum)和冰城链霉菌(Streptomyces bingchengensis)聚成一支,亲缘关系较近。培养特征结果表明,拮抗放线菌MY-5具有明显的"吸水"现象,但在基内菌丝颜色方面与密旋链霉菌不同。生理生化特征方面,拮抗放线菌MY-5与冰城链霉菌在木糖和鼠李糖利用方面存在明显差异。综合分析,初步鉴定拮抗放线菌MY-5为链霉菌属吸水类群(Streptomyceshygroscopicus)。
拮抗放线菌MY-5抗菌物质粗提液经热、酸、碱、紫外线、蛋白酶K和氯仿处理,其抗菌作用稳定性结果表明,加热、酸碱处理、紫外线照射、蛋白酶K和氯仿都会影响拮抗放线菌MY-5抗菌物质粗提液的抑菌活性,经100℃保温处理60 min,抗菌物质粗提液的抑菌活性完全丧失;抗菌物质粗提液的抑菌活性在发酵液原始pH(6)下最稳定,偏碱性条件的稳定性稍高于偏酸性条件;抗菌物质粗提液对紫外照射和蛋白酶K处理稳定,而对氯仿处理较敏感。
以拮抗放线菌MY-5无菌发酵液抑菌活性为主要指标,研究了发酵培养基中不同碳源、氮源、C/N、无机盐等营养因子,以及接种量、装液量、初始pH、发酵时间等非营养因子对拮抗放线菌MY-5无菌发酵液抑菌活性的影响。对香蕉炭疽病菌和荔枝霜疫霉病菌的抑菌测定结果表明,发酵培养基最佳碳源为葡萄糖,氮源为黄豆粉,适宜C/N为4.13:1,添加无机盐的种类为碳酸钙和氯化钠时,拮抗放线菌MY-5无菌发酵液抑菌活性较高。正交试验结果表明,发酵培养基各组分的最佳配比(质量分数)为:葡萄糖1%,黄豆粉1%,碳酸钙0.06%,氯化钠0.1%。拮抗放线菌MY-5发酵的优化条件为:初始pH6.0～7.0,发酵培养时间96 h(发酵液pH8.5),接种量(体积分数)6%～10%,装液量60mL～80mL/250 mL,摇床转速180r/min。
测定拮抗放线菌MY-5的孢子悬浮液、上清液、孢子液、抗菌物质粗提液和300μg/mL抑霉唑以及清水对照对采后柑橘接种绿霉病(Penicillium digitatum)、番茄接种灰霉病(Botrytis cinerea)和香蕉炭疽病(Colletotrichum musae)的抑制效果。其中,抑霉唑抑制效果最好,拮抗放线菌MY-5孢子悬浮液和无菌发酵液的抑制效果次之。清水对照对柑橘的发病率为96.89%,病斑直径为25.62mm;而经抑霉唑处理的柑橘发病率为10%,病斑直径为4mm;经孢子悬浮液和无菌滤液处理的柑橘的发病率分别为16.74%和18.73%,病斑直径分别为6.03mm和6.86mm。孢子液和上清液与清水对照相比亦有显著的防病效果,但防效差于孢子悬浮液和无菌发酵液。