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淫羊藿，为中医的传统补益药，其主要成分淫羊藿苷(Icariin，ICA)为黄酮苷类物质。宝霍苷Ⅰ(BaohuosideⅠ)，又称淫羊藿次苷Ⅱ(IcarsideⅡ，ICAⅡ)，是淫羊藿苷水解一分子葡萄糖的次级糖苷化合物，为淫羊藿苷在肠道内的主要代谢产物，在淫羊藿药材中含量远低于淫羊藿苷。 目的: 本课题通过研究淫羊藿苷大鼠体内药代动力学特征，阐明其在体内的主要药效物质基础。采用体外生物酶解技术将淫羊藿苷制备成活性更高的体内代谢产物宝霍苷Ⅰ，并将宝霍苷Ⅰ制备成纳米脂质体，提高其溶解度及生物利用度，为淫羊藿活性成分的药物开发奠定基础。 方法: 1.淫羊藿苷大鼠体内代谢产物鉴定及主要代谢产物药效评价 收集灌胃给药淫羊藿苷后大鼠的血浆、尿液、胆汁和粪便四种生物样本，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析淫羊藿苷在大鼠体内的代谢产物，并探索淫羊藿苷在大鼠体内的代谢途径。采用MTT法对比淫羊藿苷及其主要代谢物（宝霍苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿苷元）对肿瘤细胞的抑制作用，探究其构效关系。 2.淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ大鼠体内药物动力学比较研究 建立LC-MS/MS方法，测定大鼠血浆样品中淫羊藿苷及宝霍苷Ⅰ的含量，通过口服和静脉注射两种给药方式对比研究了淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ在大鼠体内的药动学特征，进一步探索淫羊藿苷体内药效物质基础。 3.β-葡萄糖苷酶的制备及酶解法制备宝霍苷Ⅰ的工艺研究 对绿色木霉AS3.3711菌株进行发酵培养，得到粗β-葡萄糖苷酶，并采用DNS法测定其活性、稳定性及底物特异性。通过酶谱法标示β-葡萄糖苷酶在Native-PAGE凝胶上的活性条带，SDS-PAGE对该活性蛋白分子量进行分析;将该酶用于体外酶解制备宝霍苷Ⅰ。在酶解工艺单因素考察的基础上，以淫羊藿苷转化率为指标，以pH、反应温度、底物初始浓度为影响因素，采用星点设计-响应面法设计了三因素三水平的实验优化酶解制备工艺。 4.宝霍苷Ⅰ质量控制方法及初步稳定性研究 通过红外、紫外及核磁共振技术对制备的宝霍苷Ⅰ进行结构确证。采用高效液相色谱法建立宝霍苷Ⅰ的含量测定方法，对三批制备样品进行含量分析;测定宝霍苷Ⅰ在正辛醇-缓冲液系统下的油水分配系数，以及在不同表面活性剂中的溶解度。考察宝霍苷Ⅰ在高温(60℃)、高湿(RH75％±1％)、强光(4500±500lx)下的初步稳定性。 5.宝霍苷Ⅰ纳米脂质体的制备及评价 采用薄膜分散-蒸发法，建立了宝霍苷Ⅰ纳米脂质体的制备方法，以DSPC、DSPE-PEG2000作为磷脂薄膜，以摩尔比DSPC∶ DSPE-PEG2000∶ ICAⅡ=9∶1∶1为处方，制备宝霍苷Ⅰ纳米脂质体，通过研究其粒径、电位、形态、体内药动学特征进行评价。 结果: 1.通过高分辨数据和多级碎片信息在大鼠体内共发现14种代谢产物，其中5种代谢产物为首次在体内发现。新化合物主要为淫羊藿苷、宝霍苷Ⅰ的去甲基化产物及苷元的去羟基化产物。淫羊藿苷在体内发生的Ⅰ相及Ⅱ相代谢主要反应包括去糖基化、去甲基化、羟基化和葡萄糖醛酸化。去糖基化过程主要由肠道菌群产生的β-葡萄糖苷酶催化完成。肠道及肝脏为淫羊藿苷主要代谢和转化部位，胆汁为淫羊藿苷及其代谢产物的主要排泄途径。淫羊藿苷代谢产物中以宝霍苷Ⅰ及其Ⅱ相代谢产物的含量最高。推测宝霍苷Ⅰ为主要的药效物质成分。同时MTT法研究表明，宝霍苷Ⅰ抗肿瘤活性高于其他几个代谢产物，对HepG-2肿瘤细胞有较强的抑制作用，当浓度达到50μM时，其对肿瘤抑制率可达94.7％。淫羊藿苷对肿瘤细胞几乎没有抑制作用。 2.淫羊藿苷和宝霍苷Ⅰ在血浆中的线性范围为1.03-1032 ng/mL，回归系数分别为0.9983和0.9977，最低定量限为1.03ng/mL，提取率和基质效应均在规定范围内，所建立的含量测定方法适于药代动力学研究。药代动力学结果表明:口服淫羊藿苷吸收和消除较为迅速，个体差异较大，Tmax为15±0.0 min，T1/2为39.9±39.6min，并且90％以上的淫羊藿苷转化为了宝霍苷Ⅰ，绝对生物利用度仅为0.1％。宝霍苷Ⅰ口服之后绝对生物利用度为4.4％，Tmax及T1/2分别为18±6.7min和142±49.9min，Cmax为104.5±15.7ng/mL，为淫羊藿苷在体内转化的宝霍苷Ⅰ的Cmax的2.2倍。结果表明，采用宝霍苷Ⅰ给药相比淫羊藿苷，生物利用度和血药浓度均大大提高，也减少了淫羊藿苷体内肠道转化个体差异对其药效的影响。 3.β-葡萄糖苷酶，可同时水解带芳香烃-β-葡萄糖苷及硝基苯-β-D葡萄糖苷酶类化合物，对芳香烃-β-葡萄糖苷类化合物有较高选择性，在室温下放置性质基本稳定。对粗β-葡萄糖苷酶进行分离鉴定后，确定其活性条带分子量在70 KD左右。采用该分离纯化后的高效酶制备宝霍苷Ⅰ，优化工艺为:在最适pH值4.0的缓冲条件下，将底物配制浓度为1.00 mg/mL的溶液，加入9.8U的β-葡萄糖苷酶，41℃下反应1h，淫羊藿苷转化率可达95.03％。 4.经红外、紫外及核磁共振波谱技术确认，制备的化合物为宝霍苷Ⅰ。用HPLC建立的宝霍苷Ⅰ的含量测定方法线性关系在4.94-988μg/mL范围内有良好的线性关系，精密度、稳定性、回收率实验均符合方法学考察要求，制备的三批样品经测定，含量为99.53±1.97％。宝霍苷Ⅰ的油水分配系数lgP在2.03-3.77范围内，表明宝霍苷Ⅰ脂溶性较强。宝霍苷Ⅰ在水中几乎不溶，在0.2％ SDS和0.2％ Tween-80溶解度分别为630μg/mL、360μg/mL，为宝霍苷Ⅰ制剂开发提供实验参考。稳定性实验结果显示宝霍苷Ⅰ性质稳定，不受高温、高湿、强光环境的影响。 5.采用薄膜分散-蒸发法制备的宝霍苷Ⅰ脂质体平均粒径为97.41±0.88nm，电位为-23.77±0.86 mv，药物包封率大于95％，表明宝霍苷Ⅰ纳米脂质体处方合理，制备工艺稳定。体内药动学研究表明，宝霍苷Ⅰ脂质体生物利用度为其原料药的9.8倍，体内生物利用度明显提高。 结论: 肠道及肝脏为淫羊藿苷主要的代谢及转化场所，宝霍苷Ⅰ是大鼠灌胃给药淫羊藿苷在体内的主要存在形式。体外酶解制备宝霍苷Ⅰ并制成纳米脂质体制剂，可以进一步提高淫羊藿有效成分的活性及生物利用度。