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目的:
TFF3(Trefoil Factor Family3)又称肠三叶因子,是三叶肽家族的成员之一。它含有一个特殊的P结构域,后者由38-39个氨基酸组成,通过6个高度保守的半胱氨酸残基经由3个分子内的二硫键相互连接使整个肽链扭曲折叠形成三叶状结构,使其不受消化酶和PH变化的影响,在胃肠粘膜的损伤修复过程中发挥重要作用。TFF3的高表达与结肠癌的淋巴结转移及较差的临床预后相关,然而其机制尚不明确。我们小组在国际报道:结肠癌细胞中,TFF3能够持续上调EMT调节因子TWIST1的表达。FLV12作为转录因子TWIST1的靶基因,其在结肠癌的表达增高,与结肠癌的转移相关。我们推测,TFF3可能通过上调TWIST1表达或激活其转录活性,进而上调FLV12,诱导结肠癌细胞发生EMT,促进结肠癌转移。本研究意在探讨TFF3/TWIST1/FLV12信号途径在诱导结肠癌EMT,促进其侵袭、转移过程中可能的调节机制。
方法:
1、构建实验相关表达载体,建立稳转细胞系。
2、WesternBlot技术检测TFF3在7种结肠癌细胞系的表达。
3、RealTimePCR、RT-PCR方法检测TFF3对TWIST1、FLV12转录水平的调节,WesternBlot方法检测TFF3对TWIST1、FLV12、E-CAD和FN翻译水平的调节。
4、体外GST-pulldown实验验证TWIST1与FLV12、FLV12与E-CAD的相互作用关系。免疫共沉淀确认TWIST1与FLV12在体内的相互作用。
5、双荧光素酶报告系统分析TFF3对E-CAD启动子活性的调节。
6、干扰TWIST1表达建立稳转细胞系后,WesternBlot方法检测结肠癌细胞中FLV12和E-CAD的表达。
7、免疫组化检测结肠癌中TFF3、TWIST1、FLV12蛋白表达,统计学分析三者与结肠癌病理学参数的相关性。
结果:
1、成功构建原核表达载体pGEX-5X-1-TWIST1、pGEX-SX-1-FLV12和真核表达载体pGEFP-C1-FLg12、pcDNA3.1/HisA-FLV12、pcDNA3.1/HisA-TWIST1,建立HT29/SCR、HT29/si-1W稳转细胞系。
2、TFF3在7株结肠癌细胞系中均有表达。淋巴结转移灶细胞系SW620与原发灶细胞系SW480相比,TFF3、TWIST1、FN表达增强,E-CAD表达下降。
3、TFF3过表达,在转录水平,TWIST1,FLV12mRNA的表达上调;在翻译水平,TWIST1、FLV12、FN表达增强,同时E-CAD表达下降。
4、GSTopulldown、免疫共沉淀实验证实TWIST1与FLV12在体外、体内均能相互作用,且在TFF3高表达状态下相互作用增强。
5、双荧光素酶报告系统证实TFF3能够抑制E-CAD启动子活性。干扰TWIST1的表达,其抑制作用消除。
6、体外GST-pulldown实验证实FLV12与E-CAD能够相互作用,且TFF3能增强其互作。
7、干扰TWIST1表达,FLVl2表达下调,E-CAD表达上调。
8、免疫组化结果发现,TFF3、TWIST1、FLV12在结肠癌转移灶的表达明显高于其原发灶,且三者具有相关性。
结论:
1、TFF3通过TWIST1/FLV12下调结肠癌细胞系上皮细胞标志分子E-CAD,上调间质细胞标志分子FN,诱导其发生EMT。
2、TFF3通过TWIST1上调FLV12的表达,增强二者相互作用,抑制E-CAD启动子的转录活性。
3、E3连接酶亚基FLV12能与E-CAD发生相互作用,且TFF3增强二者的互作。