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线粒体是存在于大多数真核生物中的细胞器，参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程。线粒体DNA(mtDNA)突变与人类线粒体遗传病密切相关，对于mtDNA精确矫正是治疗线粒体遗传病的重要策略。 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)技术是继锌指蛋白(zinc finger proteins，ZFPs)技术和转录激活因子样效应因子(transcription activator-like effectors，TALEs)技术之后发展起来的一种新型基因组靶向编辑修饰技术。这种源自细菌适应性免疫系统，由RNA介导Cas9蛋白剪切的全新基因组编辑技术，因其构建简单、作用效率高，经过短短几年发展，已被用于世界各地的实验室。 本研究基于人工改造的CRISPR/Cas9系统独特地构建了作用于线粒体基因组的mtCRISPR/Cas9系统。该系统主要包括两部分:定位于线粒体的Cas9核酸酶（mitochondria-targeted Cas9，mtCas9）和进入线粒体的向导RNA（mitochondria-guide RNA，mt-gRNA）。其中，mtCas9通过人鸟氨酸氨甲酰基转移酶(homo sapiens omithinecarbamoyhransferase，OTC)的线粒体前导肽信号(mitochondrialtargeting sequence，MTS)和HIV-1 rev结构域中的强出核信号(nuclearexport signal，NES)共同作用定位于线粒体，mt-gRNA由RNA线粒体定位引导序列RP(RNase P，RP)跨膜带入线粒体。 由于线粒体缺乏完善的DNA损伤修复系统，无法通过常规方法检测mtCRISPR/Cas9系统的靶向剪切活性。本研究利用转基因技术，将一段含有两个靶向目标序列(T1、T2)的线粒体DNA序列随机整合到宿主基因组中，通过实时荧光定量PCR筛选单拷贝或低拷贝的单克隆转基因细胞株。将含有T1、T2靶向目标序列的CRISPR/Cas9（mtCRISPR/Cas9）系列质粒瞬时转染到所选细胞株中，靶向剪切核基因组，在靶向目标序列处造成DNA双链断裂，引发非同源末端连接修复机制，引入插入或缺失突变。观察测序峰图，证明两个靶向目标序列T1、T2均具有剪切活性，且mtCRISPR/Cas9系统可以特异性靶向剪切线粒体基因组而非核基因组。该转基因细胞系的构建方法，对检测线粒体核酸酶靶向剪切活性具有普遍适用性。 此外，在mtDNA中，靶向目标序列T1位于线粒体4977bp普通缺失(common deletion，CD)范围内，通过将含有T1靶向目标序列的mtCRISPR/Cas9系列质粒瞬时转染到HEK293细胞中，靶向剪切mtDNA。只有当mtCas9和mt-gRNA同时存在时，才能引起mtDNA普通缺失的增加和拷贝数的降低，同样证明了mtCRISPR/Cas9系统可以特异性地靶向剪切线粒体基因组。 mtCRISPR/Cas9系统的构建，可为日后线粒体DNA损伤修复机制的研究，甚至是线粒体遗传疾病的治疗提供有力的技术支持。