【摘 要】
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目的:明确Pokemon在肝癌细胞中对CDK-1基因表达及其相关调控的分子机理。方法:细胞是人肝癌HepG-2细胞和QGY-7703细胞。将Pokemon和CDK-1的表达质粒转染至HepG-2和QGY-7703肝
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目的:明确Pokemon在肝癌细胞中对CDK-1基因表达及其相关调控的分子机理。方法:细胞是人肝癌HepG-2细胞和QGY-7703细胞。将Pokemon和CDK-1的表达质粒转染至HepG-2和QGY-7703肝癌细胞中,分别收集cDNA和蛋白通过Real-time PCR和Western-blot观察Pokemon调控CDK-1基因表达情况。构建三段ATG上游1000bp不同长度的CDK-1启动子荧光素酶报告基因载体,分别转染这三种报告基因载体到HepG-2和QGY-7703肝癌细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测法确定CDK-1启动子核心活性区域。利用双荧光素酶报告基因检测法及染色质免疫共沉淀(ChIP)试验技术证实Pokemon能否直接结合CDK-1启动子且调控其活性。结果:在HepG-2和QGY-7703肝癌细胞中,通过Realtime-PCR发现Pokemon对CDK-1基因调控在mRNA水平有明显的抑制作用。在HepG-2和QGY-7703肝癌细胞中随着Pokemon siRNA转染时间的延长,CDK-1的蛋白表达量逐步增加。应用PCR的方法成功的克隆三段不同长度的CDK-1基因启动子序列,分别对应ATG上游1018bp、541bp、242bp,再分别插入报告基因质粒载体PGL4.10中,构建得到不同长度的CDK-1启动子报告基因质粒载体。在HepG-2和QGY-7703肝癌细胞系中,通过双荧光素酶报告基因检测Pokemon对CDK-1启动子活性的下调均在pLuc-1018段最明显(P<0.01),而在pLuc-542,pLuc-242段活性的下调不明显(P>0.05),但三者都有活性。CHIP证明在HepG-2和QGY-7703肝癌细胞中,Pokemon直接与CDK-1启动子结合。结论:在HepG-2和QGY-7703肝癌细胞中Pokemon可以通过与CDK-1启动子直接结合,抑制CDK-1基因的表达。
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