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转录因子(TF)是细胞内一类调控蛋白，能特异结合基因组DNA的转录因子结合位点(TFBS)以调节基因的转录过程，在细胞多种生理和病理过程的基因表达调控中发挥了重要作用。例如，核因子-κB(NF-κB)是一种诱导型转录因子，广泛存在于各种细胞中，NF-κB二聚体可以结合基因组中κB位点，来调控许多细胞过程（例如免疫和炎症）中靶基因的表达。对于研究这类转录因子的功能，分析它们的DNA结合活性是必不可少的。所以，转录因子活性检测技术已经被高度重视，但目前的检测技术存在通量低、依赖抗体等缺点，因此，在转录因子活性研究中，发展一种高灵敏性、高通量、不依赖于抗体的新检测方法仍有必要。 滚环扩增(RCA)是一种高灵敏性等温DNA扩增技术，它具有恒温低温扩增和高灵敏性的优势，RCA已经被广泛应用于目标核酸分子的扩增检测。近红外荧光(NIRF)因其高信噪比和较强的组织穿透性而被迅速应用于生物分子的体外测定。本论文结合RCA和NIRF的技术优势，发展了一种基于近红外荧光固相RCA(NIRF-sRCA)的转录因子活性检测新方法。该方法检测转录因子前，首先设计并制备转录因子结合探针(TFBP)，捕获探针(CP)和滚环模板;其中TFBP上有含有靶转录因子的TFBS、捕获探针退火区及滚环退火区;CP经氨基修饰共价固定在醛基修饰的玻片表面，制成CP阵列;滚环模板可与TFBP上的滚环退火区杂交。该方法的基本检测流程为:(1)将TFBP与待检蛋白样品共孵育;(2)用自然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白结合TFBP与游离TFBP;(3)将蛋白结合TFBP和滚环与CP阵列杂交;(4)固相RCA扩增滚环，并通过掺入biotin-dUTP标记扩增产物;(5)近红外荧光标记的链亲和素（streptavidin-800CW）与固相RCA扩增产物结合;(6)近红外荧光成像仪扫描玻片。 本论文以NF-κB为检测对象，论证NIRF-sRCA的可行性。实验结果表明，本论文建立的近红外荧光固相RCA系统能非常灵敏地检测样品中的目标核酸分子，最低可检测10 fmol目标核酸分子。通过检测NF-κB p50纯蛋白及HeLa细胞核提取物，证明了该方法的可行性和可靠性。NIRF-sRCA可以对NF-κB p50纯蛋白进行定量检测，最低可检测6.94 ng p50纯蛋白。NIRF-sRCA检测细胞核提取物中NF-κB时，加入竞争性探针检测实验和质量梯度实验表明该方法可特异地定量检测细胞核提取物中NF-κB，最低可检测0.625μg核蛋白。同时，设计了其他5种转录因子蛋白(TFIID、p53、CREB、NF-E2、AP-1)的探针，使用NIRF-sRCA检测了HeLa细胞核提取物中6种转录因子的活性，结果表明NIRF-sRCA可特异性地同步检测HeLa细胞核提取物中6种转录因子的DNA结合活性，并确定TNF-α诱导使NF-κB上调2.54倍，TFIID上调1.43倍，p53上调1.36倍，CREB上调1.8倍，NF-E2上调1.18倍，AP-1上调1.28倍，该检测结果与TranSignal Protein/DNA array I检测结果一致。 综合上述，本论文成功建立了一种基于近红外荧光固相RCA的转录因子活性检测新方法，该方法具有高灵敏性、高通量、不依赖抗体等优点，既可用于同步检测多种蛋白样品中单个转录因子的DNA结合活性，也可同步检测同一蛋白样品中多种转录因子的活性，从而为转录因子蛋白的生物医学研究提供了新的工具。此外，本研究建立的NIRF-sRCA检测系统还可用于其它核酸分子的高灵敏性检测，如病原微生物等。