【摘 要】
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我们通过SSH方法根据一个病例的正常结肠粘膜,腺瘤及腺癌建立了三个差减文库:腺瘤相对于正常粘膜的差异片段文库(A-N),腺癌相对于正常粘膜的差异片段文库(T-N)和腺癌相对于腺
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我们通过SSH方法根据一个病例的正常结肠粘膜,腺瘤及腺癌建立了三个差减文库:腺瘤相对于正常粘膜的差异片段文库(A-N),腺癌相对于正常粘膜的差异片段文库(T-N)和腺癌相对于腺瘤的差异片段文库(T-A).通过对1999年获得的未知基因的序列分析,进行电子克隆,EST拼接,开放阅读框架预测,再经蛋白序列比较,发现其中的一个未知基因,即2001年从炎症性肠病文库中发现的RegⅣ.在对A-N文库中的109个克隆的测序分析后,我们得到了包括癌相关基因在内的各类基因,涉及9个假设蛋白,33个未知的候选新基因,其中Reg Ⅳ被筛选了13次.通过对A-N差减文库的反向Northern分析,31/40(75.2﹪)个克隆出现明显上调,3/40(7.5﹪)个较正常下调,6个与正常基本一致.其中上调的基因包括RegⅣ.在候选的差异片段中,有2个差异片段与Alu序列有关.我们用半定量RT-PCR、Northern杂交、原位杂交等方法检测Reg Ⅳ在结直肠腺瘤及结直肠癌中的表达.结论:(1)通过SSH建立文库,经克隆测序和生物信息学分析是筛选差异表达基因简便和有效的方法;(2)RegⅣ是一个在结直肠肿瘤中高表达的新基因.可能是一个预警腺瘤癌变的生物学标志.RegⅣ在结直肠肿瘤中高表达的分子机制有待进一步阐明;(3)A-N文库的测序和生物信息学分析结果对结直肠肿瘤分子机制的进一步阐明提供了许多有价值的信息,如Alu序列的插入等.对该文库的进一步深入研究有可能取得创新性结果.
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