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研究背景疟疾(malaria)是一种由疟原虫(Plasmodium spp.)引起的、以按蚊为媒介传播的全球性寄生虫病,是世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一,目前全世界约有一半人口面临疟疾风险。疟疾是一种急性发热性疾病,最初症状如发热、头痛、寒战和呕吐可能因症状较轻而难以发现,而像儿童和孕妇等免疫力低下的人群常常发展为重症疟疾,出现贫血、急性呼吸窘迫、黄疸等症状,可造成脑、肺、肝、肾等全身各脏器不同程度的损害,最终可导致死亡。目前由于人口流动频繁,生态环境改变以及抗疟药耐药性的产生等综合因素,疟疾对人类健康的威胁仍然不容忽视。在重症疟疾患者普遍都能观察到不同程度的肝功能障碍,严重的患者可出现肝功能衰竭和肝细胞坏死,这与肝内炎性细胞的浸润和免疫病理反应密切相关。Kupffer细胞(KCs)是肝脏内的巨噬细胞,构成机体防御的一道屏障,同时免疫细胞产生的促炎因子也是导致肝损伤的重要原因之一。红细胞内期是疟疾致病的主要阶段,肝脏微血管内的疟原虫通过表面特异性标志入侵、增殖并裂解红细胞,促使肝脏内的KCs大量聚集。这个过程可导致肝脏损害,说明单核巨噬细胞的浸润增生参与肝脏的免疫病理反应。同时,疟原虫感染可诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)的产生,通过IFN-α/β激活基因(ISGs)募集大量炎性细胞在肝内聚集,参与固有免疫反应来遏制疟原虫的增殖。因此,维持各种炎症因子之间的动态平衡对疟疾的结局甚为关键,但其具体的调控机制目前尚不清楚。T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子家族(T cell immunoglobulin mucin,Tim)是一类结构保守并具有重要免疫功能的新型的基因家族蛋白,其中Tim-3主要表达在Th1细胞上,能产生抑制信号导致Th1细胞的凋亡,下调Th1介导的免疫应答。凝集素家族中的半乳糖凝集素(Galectin,Gal)-9是Tim-3主要的天然配体,主要表达于CD4+T细胞表面。其选择性地结合β-半乳糖苷,与Th1细胞上的Tim-3分子特异性结合后负性刺激Th1细胞程序性死亡来抑制Th1细胞免疫功能。在病原体感染中,Tim-3和Gal-9的相互作用促进巨噬细胞吞噬病原体同时抑制T细胞应答,在急性炎症中促进T细胞凋亡而在慢性炎症中介导CD8+T细胞耗竭与无能。研究显示,NKT细胞Tim-3表达上调诱导KCs表达Gal-9,同时分泌IFN-γ导致Tim-3+NKT细胞的凋亡,可限制了炎症反应并避免破坏性免疫。目前关于Tim-3/Gal-9在疟疾肝损伤中的作用报道尚少见,本研究对其进行探讨,以期为疟疾肝损伤的防治提供新的靶向目标。研究目的和意义本论文采用Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染小鼠,通过乳糖封闭galectins研究伯氏疟原虫感染小鼠肝脏巨噬细胞的免疫调节作用研究。我们的研究结果显示,Tim-3/Gal-9通路作用于KCs,可能通过调节Ⅰ型干扰素的分泌参与疟原虫伯氏感染小鼠肝脏的免疫病理反应。第一部分1)材料和方法(1)伯氏疟原虫感染小鼠模型的建立雌性昆明小鼠腹腔注射感染1.0×106个Pb ANKA,建立鼠疟模型。(2)伯氏疟原虫感染小鼠分组及观察感染后观察小鼠生存状况;每2日从小鼠尾部采血,制备薄血膜,检测小鼠血虫感染率的动态变化,分别于感染后5、10、15和20天处死小鼠。(3)伯氏疟原虫感染小鼠组织虫荷检测采用q RT-PCR检测小鼠感染后5、10、15和20天肝、脾组织Pb ANKA虫荷m RNA表达的动态变化。(4)伯氏疟原虫感染小鼠组织病理观察肝、脾组织石蜡切片后进行H&E染色,观察并计数分析小鼠感染后肝、脾组织病理动态变化。(5)伯氏疟原虫感染小鼠组织Tim-3和Gal-9免疫组织化学染色肝、脾组织石蜡切片后进行Tim-3和Gal-9免疫组织化学染色,观察并计数小鼠感染后肝、脾组织Tim-3和Gal-9阳性细胞数量的动态表达。(6)伯氏疟原虫感染小鼠组织细胞因子检测采用q RT-PCR检测小鼠感染后肝、脾组织Tim-3、Gal-9、促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和抑炎因子(IL-10和IL-4)的m RNA表达水平的动态变化。2)结果(1)小鼠感染后7至20天内死亡,临死前的血虫感染率为62.61%‐78.63%。(2)感染小鼠肝、脾组织中Pb ANKA虫荷量动态升高。与感染后5天相比,肝脏和脾脏组织虫荷量在感染后10(P<0.05)、15(P<0.001)和20天(P<0.001)显著增高;与感染后10天相比,肝脏和脾脏组织中的虫荷量在感染后15和20天显著增高(分别为P<0.001和P<0.05)。(3)感染小鼠肝、脾组织病理损害随着时间的延长逐渐加重。(4)小鼠感染后肝、脾组织中Tim-3和Gal-9阳性细胞数量逐渐增多。(5)与正常小鼠相比,感染小鼠肝脏组织中Tim-3的m RNA表达水平显著升高,且小鼠感染后20天肝脏组织Tim-3的m RNA表达水平显著高于其他动态时间点(P<0.001)。与正常小鼠相比,感染小鼠肝脏组织中Gal-9的m RNA表达水平在5和10天显著升高(P<0.001)。与正常小鼠相比,感染小鼠脾脏组织Gal-9的m RNA表达水平在10和15天显著升高(分别为P<0.001和P<0.05)。(6)与正常小鼠相比,肝脏组织IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的m RNA表达水平在小鼠感染后显著升高,而IL-4的m RNA表达水平在小鼠感染后显著降低;与正常小鼠相比,脾脏组织IL-6和IL-10的m RNA表达水平在小鼠感染后各动态时间点显著升高,IL-1β的m RNA表达水平在小鼠感染后显著降低。3)结论小鼠感染伯氏疟原虫后,随着感染时间的延长,小鼠肝、脾组织中的虫荷量增加;肝、脾组织病理损害加重;肝、脾组织中的Tim-3和Gal-9阳性细胞数量升高,提示Tim-3和Gal-9可能参与伯氏疟原虫感染小鼠肝脏的免疫病理反应。第二部分1)材料和方法(1)伯氏疟原虫感染小鼠模型的建立雌性昆明小鼠腹腔注射感染1.0×106个Pb ANKA,建立鼠疟模型。(2)伯氏疟原虫感染小鼠分组及观察感染的部分小鼠每隔12 h腹腔注射300 m M的α-乳糖溶液封闭galectins作为乳糖封闭感染组,剩余感染小鼠作为感染组,另设正常对照组和注射同等剂量的乳糖对照组,观察感染组和乳糖封闭感染组小鼠生存状况;每日从小鼠尾部采血,制备薄血膜,检测感染组和乳糖封闭感染组小鼠血虫感染率的动态变化,分别于感染后5和7天处死小鼠。(3)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织虫荷量检测采用q RT-PCR检测感染组和乳糖封闭感染组小鼠感染后5和7天肝脏组织Pb ANKA虫荷m RNA表达水平。(4)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织病理观察肝脏组织石蜡切片后H&E染色,观察并计数各组小鼠肝脏组织病理变化。(5)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织CD68免疫组织化学染色肝脏组织石蜡切片后CD68免疫组织化学染色,观察并计数各组小鼠肝脏组织CD68阳性细胞数量的表达。(6)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织Tim-3和CD68、Gal-9和CD68荧光双染肝脏组织石蜡切片后进行Tim-3和CD68、Gal-9和CD68免疫荧光双染,观察各组小鼠肝脏组织中KCs上Tim-3和Gal-9的表达情况。(7)小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞与感染疟原虫的红细胞共培养将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞与感染疟原虫的红细胞以10:1的感染复数体外共培养24 h,采用q RT-PCR检测细胞Tim-3和Gal-9的m RNA表达水平,并比较乳糖封闭galectins后细胞IFN-α/β的m RNA表达变化情况。(8)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织Ⅰ和Ⅱ型干扰素检测采用q RT-PCR检测各组小鼠肝脏组织Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)和Ⅱ型(IFN-γ)干扰素的m RNA表达水平。(9)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织细胞因子检测采用q RT-PCR检测各组小鼠肝脏组织促炎因子(IL-6、IL-12和TNF-α)和抑炎因子(IL-10)的m RNA表达水平。(10)伯氏疟原虫感染小鼠肝组织细胞凋亡观察各组小鼠肝脏组织TUNEL染色,观察并计数各组肝脏组织细胞凋亡情况。2)结果(1)重症疟疾小鼠在感染后7至10天内死亡,而采用乳糖封闭galectins的小鼠在感染后5至7天内死亡,且乳糖封闭感染组小鼠的血虫感染率在感染后4、5和6天显著高于感染组(P<0.05)。(2)感染后5和7天乳糖封闭感染组小鼠的肝脏组织中Pb ANKA虫荷量显著高于感染组。(3)与正常对照组和乳糖对照组相比,感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织的病理损害在感染后5和7天均显著加重,且感染后5和7天乳糖封闭感染组小鼠的病理评分均显著高于感染组。(4)与正常对照组和乳糖对照组相比,感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织的CD68+KCs在感染后5和7天均显著增多,且乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织的CD68+KCs在感染后5和7天均高于感染组(P<0.001)。(5)各组小鼠肝脏组织均不同程度地出现了表达Tim-3和Gal-9的KCs。正常对照组和乳糖对照组小鼠肝脏组织的KCs数量较少,Tim-3和Gal-9的表达较弱;而感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织的KCs数量明显增多,Tim-3和Gal-9的表达较强,且乳糖封闭感染组比感染组KCs数量和Tim-3和Gal-9的表达更甚。(6)与空白对照组相比,小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞与感染伯氏疟原虫的红细胞共培养后Tim-3和Gal-9的m RNA表达水平显著升高(P<0.001);而与正常对照组和乳糖对照组相比,小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞与感染伯氏疟原虫的红细胞共培养后IFN-ɑ/β的m RNA表达水平均显著升高(P<0.001)但乳糖封闭galectins后IFN-ɑ/β的m RNA表达水平却明显降低(P<0.001)。(7)与正常对照组和乳糖对照组相比,感染后5天感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织IFN-ɑ/β的m RNA表达水平均显著升高(P<0.001),且乳糖封闭感染组低于感染组(P<0.001);而感染后7天乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织IFN-ɑ/β的m RNA表达水平也低于感染组(P<0.05)。与正常对照组和乳糖对照组相比,感染后5和7天感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织IFN-γ的m RNA表达水平均显著升高,而感染后7天乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织IFN-γ的m RNA表达水平也显著低于感染组(P<0.05)。(8)与正常对照组和乳糖对照组相比,感染后5和7天感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织IL-6、IL-12、TNF-α和IL-10 m RNA表达水平显著升高,且乳糖封闭感染组均高于感染组。(9)与正常对照组和乳糖对照组相比,感染组和乳糖封闭感染组小鼠肝脏组织的凋亡细胞在感染后5和7天显著升高(P<0.001);而乳糖封闭感染组小鼠的肝脏组织的凋亡细胞在感染后5和7天均高于感染组(P<0.001)。3)结论乳糖封闭galectins后对比发现,感染伯氏疟原虫的小鼠生存时间缩短、血虫感染率和肝组织虫荷量增高、肝脏组织病理损害加重;同时免疫组化染色显示肝内KCs数量显著增多,免疫荧光染色显示Tim-3+KC和Gal-9+KCs的数量明显增多,凋亡细胞数量显著增多,伴随着Ⅰ型干扰素表达的下降,提示Tim-3/Gal-9通路作用于KCs,可能通过调节Ⅰ型干扰素的分泌参与伯氏疟原虫感染小鼠肝脏的免疫病理反应。