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目的：在人类与疾病斗争的历史上，疫苗的发现是最具意义的。传统疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗和类毒素等。尽管这些疫苗的研发己取得了很大的成功，但在许多胞内寄生病原的疫苗开发上这些途径仍旧表现出了很大的限制性。新型疫苗（以基因疫苗为主，亚单位疫苗、结合疫苗、合成肽疫苗为辅）的问世，为疫苗的开发指明了一个全新的方向。
核酸疫苗属于基因疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗。目前以DNA疫苗研究为主。DNA疫苗（亦称裸疫苗）通过某种途径进入宿主体内后，被机体细胞所摄取，并在细胞内表达蛋白抗原，最终通过刺激使机体的免疫系统产生强烈而持久的细胞免疫和体液免疫。
与传统疫苗相比，DNA疫苗具有多方面的优点：①生产成本较低，适于大批量的生产；②使用DNA疫苗不用加佐剂，既降低成本又方便使用；③便于运输和保存；④比传统疫苗更安全，不存在减毒疫苗毒力回升的危险，也不会出现表位丢失；⑤DNA疫苗能根据需要，随时进行更新；⑥可以制成多价复合疫苗。因此，DNA疫苗具有更为广阔的应用前景。
种种优点充分表明，DNA疫苗的研发的确是一种极具潜力开发途径。但是，经过十多年的研究，至今尚无临床可用的DNA疫苗用于疾病的防治，究其原因是DNA疫苗免疫保护作用不强。
为了提高DNA疫苗的免疫保护作用，我实验室和国内外众多研究者尝试了多种方法来提高DNA疫苗的免疫保护作用。比如采用不同的接种方式以提高宿主细胞的转染效率；通过优化遗传密码或质粒的转录调控元件来提高抗原的表达；与DNA疫苗接种的同时应用编码树突状细胞特异性生长因子FLT31、GM-CSF、MIP-lα[14-16]的质粒以提高抗原提呈作用;同时应用编码IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ的细胞因子增加T淋巴细胞的扩增[17-21]等。这些方法在不同程度上提高了DNA疫苗的免疫效果，但是仍然没有达到临床防治所需的满意程度。因此，提高DNA疫苗的免疫效果仍然是DNA疫苗研发过程中的一个丞待解决的重大难题。
肌肉注射是DNA疫苗接种的常用方法。有研究认为，肌细胞在DNA疫苗接种后，可摄取并表达DNA所编码的蛋白抗原，通过交叉抗原提呈或肌细胞直接提呈途径诱导免疫反应的发生。此种说法能解释肌肉接种DNA疫苗能够诱导机体产生免疫应答的事实，但可能并未能反应肌细胞在DNA疫苗接种时所起作用的全部。一方面，肌细胞本身并无免疫共刺激分子的表达，使得其直接提呈抗原信息活化淋巴细胞的说法受到置疑，另一方面表达新抗原的肌细胞可能成为免疫细胞攻击的靶细胞，它们通过何种机制保护自身免受攻击也值得探讨。PD-1/PD-L1负性免疫调节信号通路的发现，尤其是在慢性病毒感染过程中PD-1在特异性免疫活性细胞的高表达及与之相随的功能失活提示我们，肌细胞在DNA疫苗接种后，除通过表达抗原通过交叉抗原提呈途径将抗原肽提呈给免疫活性细胞，诱导机体产生免疫应答外，可能在建立自我保护的过程中，提供负性调节信号，抑制免疫应答。即肌肉注射DNA疫苗后，肌细胞表面的PD-L1可能上调，PD-L1与T细胞上的PD-1结合下调T细胞的功能，对于肌细胞来说可以保护其免受免疫反应所造成损伤，同时也造成了免疫应答的减弱，这可能是造成DNA疫苗免疫功能不佳的原因之一。
本实验以小鼠肌细胞NOR-10为研究对象，通过用不同的方法处理小鼠肌细胞NOR-10，在不同的时间点收集细胞，进行RT-Real-Time-PCR和流式细胞术检测细胞表面PD-L1以及共刺激分子MHCI和B7分子的表达情况。探讨DNA疫苗进行肌肉注射接种后，PD-1/PD-L1信号通路可能的负性免疫调节作用。
方法：
(1)体外处理细胞：小鼠肌细胞NOR-10以5×l05的密度传到新的100ml培养瓶中，待其增殖至大约70％-80％融合时，分别以腺病毒感染细胞，脂体法质粒转染细胞，未处理细胞加新鲜培养基作为正常对照组。
(2)Trizol提取细胞总RNA:不同的方法处理小鼠NOR-10细胞后，分别在8小时、16小时、24小时、36小时，48小时提取细胞总RNA，未处理组作为正常细胞对照，进行RT-Real-Time-PCR，检测MHCI、PD-L1、B7.1、B7.2等免疫相关分子的表达。
(3)流式细胞术检测细胞表面MHCI、PD-L1、B7.1、B7.2等免疫相关分子蛋白的表达：细胞用不同的方法处理后，分别在不同时间点收集细胞，未处理组细胞作为正常对照，以l×l06个细胞/每个样本收集。按流式细胞仪样本准备操作规程进行，然后上机检测。
结果：
(1)共抑制分子PD-L1的表达：证实小鼠正常NOR-10有PD-L1mRNA但无PD-L1蛋白的表达。通过体外质粒转染，我们发现小鼠NOR-10的PD-LlmRNA表达量出现上调。发现病毒感染时，表达量出现下降。通过流式细胞术检测，我们发现通过体外质粒转染，细胞表面PD-L1蛋白表达出现上调。而经过病毒感染处理，未见PD-L1蛋白表达。
(2)共刺激分子MHCI的表达：正常的NOR-10细胞有MHCI mRNA表达，但无MHCI蛋白的表达。通过流式细胞术检测，我们发现通过体外质粒转染，细胞表面有MHCI蛋白表达。而经过病毒感染处理，未见MHCI蛋白表达。
(3)共刺激分子B7的表达：正常情况下，培养的NOR-10细胞有B7.lmRNA表达，但无B7.2mRNA的表达。通过流式细胞术检测，我们发现无论病毒感染还是质粒转染细胞表面均无B7.1和B7.2蛋白表达。
结论：
(1)正常小鼠NOR-10细胞构成性表达PD-L1，MHC-I和B7.lmRNA，但无B7.2的mRNA的表达；
(2)正常的NOR-10细胞表面无MHCI，共刺激分子B7.1蛋白的表达，也无共抑制分子PD-L1蛋白的表达；
(3)质粒转染和病毒感染可改变PD-LlmRNA、MHClmRNA的表达水平，但是对B7.1和B7.2无影响。通过质粒转染我们发现PD-L1、MHCI蛋白的表达水平提高。