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小泛素相关修饰物1(small ubiquitin-related modifier 1,SUMO1)参与的SUMO化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,且SUMO1蛋白最重要的功能之一是介导目的蛋白在核浆之间的转位。p65蛋白是NF-κB最重要的亚基之一,p65蛋白磷酸化后激活NF-κB信号通路以促进肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的进程。有文献报道,p65蛋白磷酸化与其核转移相关。本课题组前期研究发现,p65与SUMO1蛋白之间存在相互作用,过表达SUMO1可促进p65蛋白的核转移,并发现SUMO1可促进HCC的进程。此外,本课题组前期实验发现,中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)具有抑制HCC的作用,且在HCC中存在核转移的现象。同时在293T细胞中证实MANF入核后与p65蛋白的DNA结合域相互作用,抑制p65与其靶基因的启动子结合,从而发挥抑制NF-κB信号通路的作用。酵母双杂交实验发现MANF可与SUMO蛋白结合,同时软件预测出MANF是SUMO的靶蛋白。然而,SUMO1与p65蛋白磷酸化之间是否存在联系,p65蛋白的SUMO化修饰与p65蛋白的磷酸化修饰之间是否相关,以及MANF与磷酸化p65蛋白之间的联系,目前未见报道。目的:探讨SUMO1与磷酸化p65蛋白之间的关系,p65的SUMO化对p65磷酸化的影响,以及MANF与磷酸化p65蛋白之间的关系。方法:在HCC病人的肝组织中,采用免疫组织化学方法检测肝癌组织和癌旁组织中SUMO1的表达情况;在正常肝细胞株L02与肝癌细胞株SMMC-7721中,分别采用蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测SUMO1的表达及定位情况。在肝癌组织中,采用免疫荧光双标检测Ki67与SUMO1是否存在共定位;在SMMC-7721细胞中过表达或敲低SUMO1,用软琼脂克隆形成实验观察SUMO1对肝癌细胞增殖能力的影响。在肝癌组织中,采用免疫组织化学染色观察磷酸化p65蛋白的表达情况,并对肝癌组织中SUMO1及磷酸化p65蛋白之间是否存在相关性进行统计分析。在SMMC-7721细胞中过表达或敲低SUMO1,WB法检测SUMO1对磷酸化p65蛋白表达的影响。在荷瘤鼠模型中采用免疫组织化学法观察SUMO1及磷酸化p65蛋白的表达情况;采用免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测SUMO1与MANF之间有无相互作用。在肝癌组织中,采用免疫荧光双标法观察MANF与磷酸化p65蛋白之间的关系。利用本实验室已有的GFP-p65野生型(GFP-p65-wt)及GFP-p65突变体(GFP-p65-mutants)质粒,采用酶切、胶回收、连接等方法,把目的片段构建到p FLAG-CMV-6a载体上;构建的FLAG-p65-wt及FLAG-p65-mutants质粒,用于后续采用免疫共沉淀实验寻找p65的SUMO化修饰位点。结果:1.SUMO1在肝癌组织及肝癌细胞中均呈现高表达免疫组化结果显示,HCC病人肝癌组织中SUMO1的表达明显高于癌旁组织;WB结果显示,肝癌细胞株SMMC-7721中SUMO1的蛋白水平明显高于正常肝细胞株L02;免疫荧光结果显示,SMMC-7721细胞中SUMO1的表达明显高于L02细胞,且SUMO1主要定位于肝癌细胞核。2.SUMO1促进肝癌细胞的增殖免疫荧光结果显示,在HCC病人的肝癌组织中所有Ki67表达阳性的细胞,SUMO1也呈现阳性表达,说明SUMO1可能与肝癌细胞增殖相关。于是我们在SMMC-7721细胞中过表达及敲低SUMO1后,采用软琼脂克隆形成实验观察细胞的增殖情况。结果显示,与转染空载体的对照组相比,过表达SUMO1,细胞的克隆形成数明显增多;相反,与转染NC-si RNA的对照组相比,敲低SUMO1的细胞克隆形成数减少。表明SUMO1能够促进肝癌细胞增殖。3.在HCC病人的肝组织中,SUMO1与磷酸化p65蛋白呈正相关免疫组织化学染色结果显示,与癌旁组织相比,肝癌组织中SUMO1与磷酸化p65蛋白均呈现高表达,且主要定位于肝癌细胞的细胞核;相关性统计分析表明,肝组织中SUMO1与磷酸化p65蛋白呈正相关。4.在肝癌细胞SMMC-7721中,SUMO1促进p65蛋白发生磷酸化在SMMC-7721细胞中转染GFP-SUMO1质粒,蛋白免疫印迹检测磷酸化p65水平。结果发现,与对照组相比,过表达SUMO1后,磷酸化p65蛋白表达增加;相反,当转染SUMO1-si RNA质粒用于敲低SUMO1后,磷酸化p65蛋白表达减少。表明SUMO1能够促进p65蛋白发生磷酸化。5.在MANF敲除的荷瘤鼠模型中,SUMO1及磷酸化p65蛋白的相关在荷瘤鼠模型中采用免疫组化的方法检测SUMO1及磷酸化p65的表达情况。结果显示:与NC-sh RNA组相比,MANF-sh RNA组在给予PBS处理后,SUMO1及磷酸化p65蛋白表达均明显增加;而MANF-sh RNA组再给予人重组MANF蛋白处理后,SUMO1及磷酸化p65蛋白又均有相应的减少。表明在MANF敲除的荷瘤鼠模型中,SUMO1与磷酸化p65蛋白相关。6.肝癌细胞SMMC-7721中,SUMO1可以对MANF蛋白进行SUMO化修饰将SMMC-7721细胞中转入外源性质粒FLAG-MANF后再给予TNF a刺激,然后进行免疫共沉淀实验(Co-IP),并采用蛋白免疫印迹实验检测MANF及SUMO1的表达情况。检测结果表明,MANF蛋白可被SUMO1进行SUMO化修饰。7.HCC病人的肝癌组织中,MANF与磷酸化p65蛋白共定位免疫荧光检测结果显示,在HCC病人的肝癌组织中,MANF与磷酸化p65蛋白之间存在共定位,且二者主要定位于细胞核。8.FLAG-p65-wt及FLAG-p65-mutants的构建利用本实验室已有的GFP-p65-wt/mutants质粒,构建FLAG-p65-wt及FLAG-p65-mutants质粒。对p FLAG-CMV-6a载体以及GFP-p65-wt/mutants采用酶切,胶回收、连接、小抽等方法进行处理后获得相应质粒,并对质粒再次酶切鉴定,最后对可能正确的质粒进行测序检测所得质粒是否正确。测序结果表明FLAG-p65-wt及FLAG-p65-mutants质粒构建成功。结论:1.HCC病人的肝癌组织及肝癌细胞中SUMO1均呈现高表达;且SUMO1能够促肝癌细胞的增殖;2.HCC病人的肝组织中,SUMO1与磷酸化p65蛋白密切相关;3.SUMO1可以对MANF蛋白进行SUMO化修饰;且MANF蛋白与磷酸化p65存在共定位。