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第一部分顺铂腹腔注射诱导大鼠耳聋模型的实验研究目的:探索顺铂腹腔注射诱导大鼠耳聋模型的最佳剂量及实验条件。材料与方法:健康Wister大白鼠50只,雌雄各半,体重200±20g,6-8周龄。购于中国医科大学实验动物中心。将50只大鼠按照随机数字法平均分为5组:空白对照组;模型1组;模型2组;模型3组;模型4组,每组10只。除空白对照组外,其余四组大鼠均经腹腔给予不同剂量的顺铂注射液注射,方法如下:空白对照组:每只大鼠给予生理盐水注射液腹腔注射,剂量为1ml/100g·d-1,连续给药5天。模型1组:每只大鼠给予0.4mg/ml浓度的顺铂注射液腹腔注射,剂量为0.5ml/100g·d-1,连续给药5天(相当于2mg/Kg)。模型2组:每只大鼠给予0.8mg/ml浓度的顺铂注射液腹腔注射,剂量为0.5ml/100g·d-1,连续给药5天(相当于4mg/Kg)。模型3组:每只大鼠给予1.6mg/ml浓度的顺铂注射液腹腔注射,剂量为0.5ml/100g·d-1,连续给药5天(相当于8mg/Kg)。模型4组:每只大鼠给予3.2mg/ml浓度的顺铂注射液腹腔注射,剂量为0.5ml/100g·d-1,连续给药5天(相当于16mg/Kg)。实验结束后,对各组大鼠听阈ABR阈值进行检测,同时观察耳蜗毛细胞的病理改变。结果:1.各组大鼠的一般状态及死亡率空白对照组大鼠精神状态良好,活动度正常,食水量正常,给予击掌噪音刺激,耳廓反应灵敏。模型1组大鼠精神状态较好,活动度略有减少,食水量正常,给予击掌噪音刺激,耳廓反应较空白组反应略显迟钝,至实验结束,未出现死亡大鼠。模型2、3、4组大鼠精神状态较差,尤其3、4组,蜷缩于笼子角落,很少活动,食水量也明显减少,模型4组大鼠在实验的第4-5天几乎没有进食,给予击掌噪音刺激,耳廓反应非常迟钝,模型4组大鼠耳廓反应阴性。模型2组大鼠未见死亡情况出现,而模型3、4组大鼠出现死亡。模型3组于实验第3天死亡1只、第5天死亡2只,总死亡率30%;模型4组于实验第2天死亡1只、第3天死亡1只、第4天死亡1只,第5天死亡3只,总死亡率50%。2.各组大鼠ABR检测结果各组大鼠ABR听阈检测结果显示:与空白对照组大鼠比较,模型1、2、3、4组大鼠ABR阈值显著升高(p<0.01),有统计学差异。由模型1、2、3、4组组间比较结果可知,随着顺铂注射剂量的加大,ABR阈值明显升高。3.耳蜗基底膜毛细胞形态学观察(1)耳蜗基底膜铺片各组大鼠耳蜗基底膜铺片结果显示:空白对照组大鼠耳蜗基底膜铺片清晰可见完整的三排毛细胞,排列均匀、整齐,无缺失及坏死细胞出现。模型1组大鼠基底膜铺片上,明显可见毛细胞缺失情况,但大部分排列仍然较为均匀整齐,仅偶见缺失。模型2组大鼠基底膜铺片可见大面积形态模糊的毛细胞排列,大体形态排列仍较为整齐,模型3组和4组大鼠基底膜毛细胞形态丧失,无法辨认毛细胞形态,偶见3-5个毛细胞轮廓排列在一起。(2)耳蜗病理各组大鼠耳蜗病理切片HE染色结果显示:通过病理切片HE染色,可清晰的分辨耳蜗毛细胞形态及排列情况。空白对照组大鼠耳蜗毛细胞排列整齐均匀,可见毛状结构附着于基底膜上。模型1组大鼠耳蜗基底膜毛细胞排列均匀整齐,偶见缺失,但毛状结构稀疏。模型2组大鼠耳蜗基底膜毛细胞缺失明显,毛状结构溶解。模型3组和4组大鼠耳蜗基底膜毛细胞缺失明显,排列紊乱,几乎见不到毛状结构附着。结论:1.顺铂给予大鼠腹腔注射的方法,可导致大鼠ABR阈值的升高及耳蜗毛细胞的损伤。2.顺铂2mg/kg,日一次,连续5日给药的剂量可导致大鼠耳蜗损伤,但不足以作为耳聋动物模型,用于科研实验。3.顺铂8mg/kg和16mg/kg,日一次,连续5日给药的剂量可导致大鼠耳蜗毛细胞过度损伤,不适合作为耳聋动物模型,用于科研实验。4.顺铂4mg/kg,日一次,连续5日给药的剂量可导致大鼠耳蜗损伤,损伤程度适中,模型稳定,可作为耳聋动物模型,用于科研实验。第二部分川芎嗪对顺铂诱导耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞凋亡内部途径干预机制的实验研究目的:探索川芎嗪对顺铂诱导的耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞凋亡早期内部途径的干预作用和机制。材料与方法:将62只大鼠采用随机数字法平均分为两组,分别为:正常组(N组,11只),模型复制组(M组,51只)。正常组大鼠不做处理,正常饲养;模型复制组大鼠采用顺铂腹腔注射的方法诱导药物性耳聋模型。模型复制成功后,再次采用随机数字法,将正常组大鼠随机分成两组:正常对照组(N1组)、川芎嗪对照组(N2组);将模型复制组大鼠随机分为两组:模型对照组(M1)、川芎嗪治疗组(M2)。实验第1-5天:正常组给予生理盐水腹腔注射,5ml/kg体重,连续注射5天。模型复制组给予腹腔注射顺铂注射液,4mg/kg体重,连续注射5天。实验第6-12天:正常对照组给予生理盐水腹腔注射,5ml/kg体重,连续注射7天。川芎嗪对照组给予川芎嗪注射液腹腔注射,140mg/kg体重,连续注射7天。模型对照组给予生理盐水腹腔注射,5ml/kg体重,连续注射7天。川芎嗪治疗组给予川芎嗪注射液腹腔注射,140mg/kg体重,连续注射7天。末次给药后1h,处死大鼠,剥离耳蜗组织,动存于-80℃冰箱中,用于p53、bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3 m RNA及蛋白表达水平检测。结果:1.模型评价结果模型复制后,N组和M组大鼠ABR检测结果显示:与正常组大鼠比较,模型复制组大鼠ABR阈值显著升高(p<0.01),有统计学意义。N组大鼠耳蜗基底膜毛细胞排列整齐,分布均匀,无明显的细胞缺失情况;M组大鼠耳蜗基底膜毛细胞大部分变形,排列紊乱,可见大量溶解破坏的毛细胞,细胞间连接残缺不全。2.各组大鼠耳蜗组织中p53、bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3蛋白表达水平实验结果显示:与空白对照组比较,模型对照组及模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中bax、p53、caspase-3、9蛋白表达水平显著升高,而bcl-2蛋白表达水平显著下降(p<0.01);与模型对照组比较,模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中bax、p53蛋白表达水平显著降低,而bcl-2蛋白表达水平显著升高(p<0.01);空白对照组及空白加川芎嗪组组间比较,各指标均无显著性差异(p>0.05)。3.各组大鼠耳蜗组织中p53、bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3 m RNA表达水平实验结果显示:与空白对照组比较,模型对照组及模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中bax、p53、caspase-3、9 m RNA表达水平显著升高,而bcl-2 m RNA表达水平显著下降(p<0.01);与模型对照组比较,模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中bax、p53、caspase-3、9 m RNA表达水平显著降低,而bcl-2 m RNA表达水平显著升高(p<0.01);空白对照组及空白加川芎嗪组组间比较,各指标均无显著性差异(p>0.05)。结论:1.给予大鼠顺铂腹腔注射(剂量4mg/kg),每日一次,连续5天,可成功诱导药物性耳聋大鼠模型。2.川芎嗪可显著下调模型大鼠耳蜗组织中的p53、bax、caspase-9、caspase-3 m RNA及蛋白表达水平,上调bcl-2 m RNA及蛋白表达水平。3.川芎嗪对药物性耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞的抗凋亡作用可能是通过阻断或抑制细胞凋亡起始阶段的内部途径而实现的。第三部分川芎嗪对顺铂诱导耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞凋亡外部途径干预机制的实验研究目的:探索川芎嗪对顺铂诱导的耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞凋亡早期外部途径的干预作用和机制。材料与方法:将62只大鼠采用随机数字法平均分为两组,分别为:正常组(N组,11只),模型复制组(M组,51只)。正常组大鼠不做处理,正常饲养;模型复制组大鼠采用顺铂腹腔注射的方法诱导药物性耳聋模型。模型复制成功后,再次采用随机数字法,将正常组大鼠随机分成两组:正常对照组(N1组)、川芎嗪对照组(N2组);将模型复制组大鼠随机分为两组:模型对照组(M1)、川芎嗪治疗组(M2)。实验第1-5天:正常组给予生理盐水腹腔注射,5ml/kg体重,连续注射5天。模型复制组给予腹腔注射顺铂注射液,4mg/kg体重,连续注射5天。实验第6-12天:正常对照组给予生理盐水腹腔注射,5ml/kg体重,连续注射7天。川芎嗪对照组给予川芎嗪注射液腹腔注射,140mg/kg体重,连续注射7天。模型对照组给予生理盐水腹腔注射,5ml/kg体重,连续注射7天。川芎嗪治疗组给予川芎嗪注射液腹腔注射,140mg/kg体重,连续注射7天。末次给药后1h,处死大鼠,剥离耳蜗组织,动存于-80℃冰箱中,用于fas/fas L、caspase-8m RNA及蛋白表达水平检测。结果:1.各组大鼠耳蜗组织中fas/fas L、caspase-8蛋白表达水平实验结果显示:与空白对照组比较,模型对照组及模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中fas/fas L、caspase-8蛋白表达水平显著升高(p<0.01);与模型对照组比较,模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中fas/fas L、caspase-8蛋白表达水平显著降低(p<0.01);空白对照组及空白加川芎嗪组组间比较,各指标均无显著性差异(p>0.05)。2.各组大鼠耳蜗组织中fas/fas L、caspase-8 m RNA表达水平实验结果显示:与空白对照组比较,模型对照组及模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中fas/fas L、caspase-8 m RNA表达水平显著升高(p<0.01);与模型对照组比较,模型加川芎嗪组大鼠耳蜗组织中fas/fas L、caspase-8 m RNA表达水平显著降低(p<0.01);空白对照组及空白加川芎嗪组组间比较,各指标均无显著性差异(p>0.05)。结论:1.川芎嗪可显著下调模型大鼠耳蜗组织中的fas/fas L、caspase-8 m RNA及蛋白表达水平。2.川芎嗪对药物性耳聋模型大鼠耳蜗毛细胞的抗凋亡作用可能是通过阻断或抑制细胞凋亡起始阶段的外部途径而实现的。