论文部分内容阅读
为了解目前广东地区禽白血病的流行状况,分析广东地区禽白血病病毒(ALV)流行株的遗传演化特点和病毒亚群分布,本研究通过组织病理学观察,利用细胞培养、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA)从2008-2009年送检的疑似禽白血病感染的临床样品中分离鉴定出7株禽白血病病毒(ALV),其中6株为ALV-J,分别命名为：ZH-08株、SCAU-0901株、SZ-08株、XG-09株、XXl-09株和XX2-09株；另1株为ALV-A,命名为GD-08株。通过分段扩增的方法,完成了各分离株的前病毒基因组DNA序列测定,GD-08株、ZH-08株、SZ-08株、SCAU-0901株、XG-09株、XXl-09株和XX2-09株前病毒全基因组长度分别为7712bp、7597bp、7616bp、、7463bp,7638bp、7614bp和7625bp。全基因组序列分析结果表明,所有分离株在基因组结构上符合典型的复制完全型反转录病毒的特点,均没有原癌基因的插入。
将分离鉴定的7株ALV流行株的gp85核苷酸序列与国内外各参考株相同区域核苷酸序列进行相似性分析,各分离株的gp85核苷酸序列的相似性在43.2％-98.0％之间；与J亚群参考株HPRS-103的相应核苷酸序列相似性在48.3％～95.2％之间,除GD-08株外,各ALV-J分离株的gp85与HPRS-103株相应核苷酸序列相似性在94.0％左右；与A亚群参考株RAV-1的相应核苷酸序列相似性在43.8～88.5％之间,GD-08株gp85与参考株RAV-1的相应核苷酸序列相似性最高,为88.5％。通过gp85基因系统遗传进化树分析发现,所有ALV-J分离株共处于一个大进化支,分支内ZH-08、SCAU-0901、SZ-08三株ALV-J亲缘关系较近；相对于其它ALV-J分离株,生长障碍病鸡源的XXl-09、XX2-09、XG-09三株亲缘关系较近。GD08株与A亚群美国株MQNCSU的亲缘关系最近,与各A亚群分离株同在一个进化支上。
为了简单、快速的检测ALV-J,本研究针对ALV-J前病毒基因组中的pol和gp85建立了一种可视化的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,ALV-J LAMP法可在60℃恒温条件下,孵育45min即可完成扩增,最低检测限可达5个靶基因拷贝,较常规PCR的敏感性高出20倍。应用此方法对ALV-A、ALV-B、ALV-E、ALV-J、REV、AIV等病毒进行LAMP检测,只有ALV-J检测结果显示阳性,表明本文的ALV-J LAMP法具有高特异性。为了更快更简便地判定反应
结果,本研究使用了两种肉眼判定方法：一是由于LAMP反应中有大量的焦磷酸镁沉淀生成,LAMP反应结束后观察反应管的浑浊度即可判定结果,阳性反应管呈现浑浊,阴性反应管呈现清澈；二是向反应产物中添加染色用的SYBR green I荧光染料,观察反应管的颜色变化,阳性反应产物显示黄绿色,阴性反应产物显示橘红色。为了评估LAMP法临床应用的可行性,对送检的49份可疑禽白血病感染的临床样品进行ALV-J LAMP检测,同时进行PCR检测和病毒分离鉴定,结果显示LAMP、PCR和病毒分离的检测阳性率分别为53.1％(26/49)、42.9％(21/49)、41.3％(19/46),相比病毒分离,LAMP法和PCR法阳性结果符合率分别为94.7％(18/19)和89.5％(17/19),可见ALV-J LAMP具有较高的可靠性。本研究建立的ALV-J LAMP方法所需仪器设备简单,结果判定简便,耗时短,具备应用于J亚群禽白血病快速诊断的潜在价值。