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以Cecropins为代表的昆虫抗微生物肽具有抗菌高效、广谱，不仅对革兰氏阴性和阳性菌有广谱的抑杀效果，而且对某些真菌、原生动物甚至病毒和肿瘤细胞都有一定的抑制作用。同时具有良好的热稳定性，并且对人和畜禽动物安全无毒，对环境友好。其独特的杀菌机理不易诱发病原菌产生耐药性。昆虫抗微生物肽的这些优点，使它成为目前医药行业研究新型抗生素的理想“替代品”，也是果蔬、食品等农副产品加工业研发新型的生物防腐保鲜剂的理想对象。
为将昆虫抗微生物肽丌发成为一类新型的天然防腐保鲜剂，本课题组桑延霞在2005年成功的将果蝇(Drosophilamelanogaster)抗真菌肽同系物基因Drosomycin(Drs)、drosomycin-lC和斑腹刺蜢蝽(Podisusmaculiventris)抗微生物肽基因thanatin分别插入甲醇诱导型分泌表达载体pPICZQA中，并转化毕赤酵母GS¨5宿主菌，在甲醇诱导下分泌表达了上述三种抗微生物肽基因。但由于表达量不够，因此只有在将发酵液上清浓缩2倍后才能在电泳中检测到目的蛋白和在抑菌试验中达到对供试真菌、细菌的抗性水平。由于使用甲醇诱导型载体必需添加诱导剂甲醇，而且在诱导剂的添加量上不易控制，因此甲醇会或多或少地残留于发酵液上清，如果直接将其用于果蔬、食品等农副产品的防腐保鲜，将会对人和畜禽动物产生毒副作用。
为了消除甲醇带来的负面影响，同时也希望能进一步提高抗微生物肽基因在酵母系统中的分泌表达产量，降低生产成本。本研究在通过利用酵母偏爱密码子改造Drs和thanatin基因的基础上，改用含有组成性表达启动子GAP和酿酒酵母分泌信号肽Q因子的新型载体pGAPQA，此载体与pPICZQA载体相比，其优点在于不需要甲醇诱导，且能够为目的基因提供相当于甲醇诱导型启动子AOXI水平甚至更高的表达量。
为了达到在酵母中组成型表达Drs和thanatin基因的目的。本研究构建了pGAPαA-drs和pGAPQA-thanatin重组子，并将其成功转化至毕赤酵母X33宿主菌中。通过对发酵条件的优化，Tricine-SDS-PAGE结果显示两者在酵母中均得到了分泌表达。继续通过抑菌试验近一步证实发酵液上清中的表达产物已经达到了对供试的多种果蔬和植物病原真菌抑杀的效果。
主要研究结果如下：
1．分别根据GenBank上登录的果蝇抗真菌J~UDrosomycin(drs)基因序列和由斑腹刺螠蝽抗微生物肽thanatin的成熟肽序列而推导出的碱基序列，利用酵母偏爱密码子对两者进行改造，在保证氨基酸序列保存不变的前提下，将Drs和thanatin基因中的碱基全部替换为酵母偏爱密码子。
2．采取PCR分段互补合成的方法直接合成新的Drs基因。设计4条互补引物，并分别在其上游引物的5’端加A．XhoI的酶切位点和Kex2肽酶的切割序列AGAGAG。在下游引物的5’端加)~XbaI酶切位点和终止子TAA。进行三步PCR反应，最终得到优化后的Drs基因。对于thanatin基因的改造，则通过设计其上下游引物直接从本课题构建的pPICZaA-thanatin重组载体，通过PCR扩增获得。
3．将上述优化后的Drs基因和thanatin基因在XhoI和dbaI两种酶酶切后，克隆至酵母表达载体pGAPαA中相应的多克隆位点处，转化宿主菌DH5a，经PCR鉴定和酶切鉴定确认后进行测序。将获得的重组载体分别命名为pGAPQA-drs和pGAPQA-thanatin。
4．利用SacI酶将pGAPQA、pGAPQA—drs和pGAPQA—thanatin质粒分别线性化后，通过电转化，使其与毕赤酵母X33宿主菌的基因组整合，重组的酵母转化子经Zeocin抗生素浓度梯度筛选和PCR鉴定后，将获得的阳性克隆菌株进行发酵培养。
5．为提高目的基因在发酵培养过程中分泌表达的产量，同时防止宿主菌对目的蛋白的降解。分别采用了在发酵培养24h后换新鲜培养液继续培养和在发酵培养液中添加1％的酸水解干酪素等措施。直接用培养液上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳即可检测到目的蛋白泳带。
6．将发酵培养72h后的菌液离心，将获得的上清液在沸水中处理10min后，进行抑菌活性的检测。结果表明两种抗真菌肽表达产物显示出一定的抗性差异：thanatin对黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、长柄链孢菌(Alternarialongipe)、荔枝炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、柑桔绿霉(Penicilliumdigitatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)等5种植物和果蔬病原真菌菌丝的生长有不同程度的抑制作用，但对荔枝霜疫霉(Peronophthoralitchii)无明显效果；Drs对前4种病原真菌菌丝有不同程度的抑制作用，但对瓜果腐霉和荔枝霜疫霉无明显效果。含有thanatin的发酵上清液还对大肠杆菌标准菌株K12D31有抗性。