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新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的严重威胁养禽业的传染病。干扰素（Interferons,IFNs）是宿主天然免疫的关键因子,NDV感染机体后,细胞的病原模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（PAMPs）后与线粒体外膜中的接头蛋白（MAVS）结合,激活TANK结合激酶1（TBK1）。由于鸡缺乏调节因子IRF3,TBK1进一步激活IFN调节因子IRF7。激活的IRF7移位到细胞核中与ISRE结合,诱导I型干扰素表达,通过JAK/STAT通路激活大量的ISGs表达,其中包括鸡源干扰素刺激基因12-2[Interferon-stimulated gene 12（2）,ISG12（2）],发挥抗病毒作用。本实验室前期研究发现,NDV感染鸡后能明显上调ISG12（2）的表达,体外实验证实ISG12（2）能抑制NDV的复制,同时IFNs能刺激鸡胚成纤维细胞（DF-1）表达ISG12（2）。同时,ISG12（2）也能促进干扰素及干扰素信号通路一系列分子的表达,表明ISG12（2）对IFN存在正向调节。基于此,推测表达ISG12（2）的NDV载体疫苗,能提高宿主对疫苗的免疫反应,增强疫苗免疫效果,提高对宿主的保护率。本研究首先通过将ISG12（2）嵌合到NDV弱毒载体LaSota上,然后通过本实验室熟练应用的NDV反向遗传操作系统,成功拯救获得ISG12（2）嵌合株,并验证了嵌合株既具有NDV活性,又能成功表达ISG12（2）蛋白,通过检测MDT,ICPI,感染6周龄低抗体鸡,实验结果表明,ISG12（2）嵌合株能显著降低病毒的致病性。最后用拯救的ISG12（2）嵌合株免疫6周龄低抗体鸡,HI抗体效价可以达到免疫保护线24以上,能起到免疫保护效果,免疫三周后用强毒株F48E9攻毒,鸡都能100%存活,体外排毒结果也显示ISG12（2）嵌合株能明显减短排毒时间,转录组结果表明ISG12（2）嵌合株不仅能激活体液免疫,还能激活细胞免疫,发挥更好的免疫保护效果。综上所述,ISG12（2）LaSota嵌合株能刺激机体产生更好的免疫保护效果,ISG12（2）具备作为分子佐剂的能力。本论文的主要研究内容和结果如下:1.ISG12（2）正向调控IFNs的机制探究为了初步探究ISG12（2）如何调节IFN及其通路相关因子的表达,首先构建既能表达ISG12（2）蛋白又能表达EGFP蛋白的质粒pCMV-ISG12（2）-EGFP。然后验证其功能,发现该质粒能抑制NDV的复制,并上调IFN及其通路相关因子的表达。为了提高转录组测序样本质量的可靠性,先将质粒转染于DF-1细胞中,36 h后通过流式分选出表达ISG12（2）蛋白的细胞,提取RNA,进行转录组测序分析。结果显示表达ISG12（2）后,相比不表达ISG12（2）的对照组,共有差异表达基因1327个,其中差异上调表达基因有709个,差异下调表达基因618个,并且KEGG通路富集分析发现,主要的富集通路有m TOR信号通路,TGF-β信号通路,Toll样受体信号通路,细胞因子相互作用信号通路和甲型流感通路等,这些通路都与免疫相关。挑选差异表达基因IFNGR1,IL1R2,IFNAR2,IFNAR1,GHR,CXCR1,CXCL12,CSF1,SMURF2,ACVR2A,SKP1,RPS6KB1进行q RT-PCR验证,检测结果与转录组测序结果相符,说明ISG12（2）的确参与免疫调节,具备激活天然免疫和增强适应性免疫的功能。2.ISG12（2）NDV嵌合株的拯救及生物学特性测定将ISG12（2）嵌合到LaSota病毒载体上拯救毒株。通过PCR、酶切、连接等分子克隆方法,在NDV LaSota原始株（r LaSota）和F蛋白裂解位点突变株（r LaSota/Fmut）的全基因组载体中插入ISG12（2）。在此基础上,借助实验室NDV反向遗传系统,成功拯救了r LaSota、r LaSota/Fmut、r LaSota-ISG12（2）、r LaSota-ISG12（2）/Fmut毒株。通过Western Blot和间接免疫荧光,验证了拯救的嵌合株既能高效表达ISG12（2）蛋白,又具有NDV活性。通过细胞因子检测、病毒增殖能力及致病性测定发现,表达ISG12（2）的嵌合株,相比未表达的NDV,在体内和体外均能更好地促进IFNs、IL-16、IL-18、IL-22等细胞因子的表达,抑制NDV的增殖,从而降低病毒的致病性。病理组织切片观察发现,嵌合了ISG12（2）的毒株感染鸡后,并未在脾脏、法氏囊等免疫器官中引起相关的炎症病理变化。3.嵌合ISG12（2）的LaSota毒株的免疫保护效果评估将成功拯救的毒株通过点眼滴鼻的接种方式,以105 EID50的接种剂量6周龄低抗体鸡,进行免疫-攻毒保护试验。NDV强毒株F48E9攻毒后,通过抗体效价的动态变化监测,4株拯救的病毒均能诱导鸡产生高抗体。通过病毒体外排泄、病毒载量、组织病理变化和存活率的检测发现,r LaSota-ISG12（2）拯救毒株能100%保护鸡群,明显减少病毒体外排泄,降低组织的病毒载量,且阻止NDV强毒株对各组织的病理损伤。进一步研究发现r LaSota-ISG12（2）组,相对r LaSota组,明显上调IFNα、IFNβ、IL-16、IL-18、IL-22等免疫相关因子的表达,并且这些细胞因子的上调,并不会导致脾脏等相关免疫组织的病理变化,避免了细胞因子风暴引起的不良反应。通过对免疫后鸡的脾脏进行转录组测序分析发现,嵌合ISG12（2）后的LaSota拯救毒株,免疫后能更好地激活鸡的体液免疫和细胞免疫,促使该弱毒株发挥更好的免疫保护作用。综上所述,本研究成功构建并拯救了表达ISG12（2）的NDV嵌合株。该嵌合株,借助ISG12（2）促进干扰素、白介素等细胞因子表达的功能,降低病毒的致病性,并且增强鸡的天然免疫和适应性免疫途径,更好地防控鸡不被NDV强毒株感染。这些研究结果,为以鸡源ISG12（2）为分子佐剂增强家禽疫苗的免疫原性,提高疫苗的保护效果,奠定了基础。