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阿糖腺苷(vidarabine,9-βD-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤)是一种天然抗病毒核苷类化合物,具有广谱的抗菌、抗病毒活性。关于合成阿糖腺苷的方法主要包括化学合成法和生物合成法,利用化学合成法合成阿糖腺苷普遍存在步骤多、区域选择性差、反应条件苛刻、产率低、原料成本高以及环境污染等问题,而利用微生物核苷磷酸化酶的高选择性生物转化合成阿糖腺苷是一种理想的方法,目前已成为核苷类药物合成研究的研究热点。近年来国内外利用生物酶法合成阿糖腺苷的研究虽然不少,但普遍存在反应体系底物与产物浓度较低,菌体酶活不高和生产成本较高等问题,制约了该方法在规模化工业生产中的应用。
本论文研究了利用选择培养基从土壤中筛选具有高核苷磷酸化酶的菌种资源,结果通过富集培养筛选到数十株具有核苷磷酸化酶活性的细菌;分别对其核苷磷酸化酶酶活力进行分析,结果显示,AEM0812菌株的尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶较高,通过分子生物学16S rDNA初步鉴定为Escherichia sp.AEM0812菌株。对该菌株进行了产酶培养条件分析和产酶培养基配方优化,结果显示,该菌株最适培养生长与产酶温度为37℃,最适产酶pH7.5-8.0,15L发酵罐通气培养最佳产酶发酵时间为8-9h,在产酶基础培养基中分别添加6％的糖Y、0.08％的营养盐S1、0.08％的营养盐S2和0.06％的营养盐S3既能显著提高Escherichia sp.AEM0812菌株的酶总量又能提高尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的酶活力。
论文进一步研究了利用Escherichia sp.AEM0812菌株的游离细胞和固定化细胞进行生物转化合成阿糖腺苷试验,并通过多种鉴定方法(显色法、高效液相色谱法、红外光谱法、核磁共振法)对其合成产物进行鉴定,结果显示合成产物为阿糖腺苷。对转化反应条件进行分析,建立了转化阿糖尿苷酶促合成阿糖腺苷的反应体系,结果显示,最适转化反应温度为55℃,最适反应时间为65h,磷酸钾缓冲液最适pH值和浓度分别为7.0、20mmol/L,反应底物阿糖尿苷和腺嘌呤最适浓度分别为60mmol/L、71mmol/L。
利用优化后的反应体系和产酶发酵培养基分别进行了100L和300L的放大试验,结果表明利用优化后的产酶培养基37℃通气产酶发酵12-14h的Escherichia sp.AEM0812菌株游离细胞进行转化反应60h,阿糖尿苷转化率为78.17％,反应液阿糖腺苷产物浓度达9.38g/L。该研究结果与之前国内外相关研究相比较,在底物浓度、产物浓度和阿糖尿苷转化率等方面都得到了大幅度提高,如国内外研究中比较好的体系中阿糖尿苷浓度为30 mmol/L,阿糖尿苷转化率25-30％(腺嘌呤转化率75-90％),产物浓度2.0-2.4g/L;与之相比本研究中底物浓度提高了63.8％,产物浓度提高了2.9-3.7倍,阿糖尿苷转化率提高了161-213％。由于反应底物浓度、转化率都得到提高,降低了产物合成成本,使阿糖腺苷微生物转化合成法进行规模化工业生产成为可能。