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Jaspine B是从海洋海绵中提取出来的天然产物,对多种肿瘤细胞具有良好的细胞活性。前期研究发现,合成的许多Jaspine B衍生物对多种肿瘤细胞也具有抑制增殖作用,但是它们的抗肿瘤功能及分子机制没有被深入探讨,以及在膀胱癌细胞中的研究稀少。本课题中,新的Jaspine B衍生物C-2被合成,其对膀胱癌细胞呈现出显著的生物活性,本文就C-2对膀胱癌细胞的抗肿瘤作用机制及其诱导的自噬与凋亡之间的相互作用关系做出深入研究。其主要结果如下:1.MTT检测C-2对膀胱癌细胞的活性,得知C-2以时间-浓度依赖方式显著降低膀胱癌细胞(BIU87,EJ与5637)的存活率,并且BIU87与EJ细胞较为敏感。Annecxin V-FITC/PI双染流式检测凋亡结果显示,C-2促进膀胱癌细胞BIU87与EJ的凋亡。2.探讨C-2是否通过线粒体途径诱导细胞的凋亡,利用JC-1流式细胞术检测得知,C-2随着浓度的增加逐渐降低了BIU87与EJ细胞的线粒体膜电位。Western blot分析表明C-2上调促凋亡蛋白Bax并下调抗凋亡蛋白Bcl-2与XIAP的表达,而且激活了Caspase9与Caspase3蛋白,证明线粒体途径介导C-2诱导的膀胱癌细胞凋亡。3.为了确定C-2是否具有诱导膀胱癌细胞发生自噬的作用,利用western blot检测得知C-2上调膀胱癌细胞中自噬蛋白Beclin-1,P62,Atg7,Atg3与Atg5的表达并且促进LC3Ⅰ转变为LCⅡ蛋白。免疫荧光方法检测LC3蛋白的变化,结果显示C-2促进BIU87细胞中的LC3表达。探讨自噬流的状态,自噬早期抑制剂LY294002抑制了LC3Ⅱ的表达,自噬后期抑制剂Baf-A1进一步增强了LC3Ⅱ的表达,证明C-2可以诱导膀胱癌细胞发生自噬。4.探讨C-2诱导自噬发生的途径,利用western blot检测得知C-2可使BIU87与EJ细胞中的JNK与c-Jun蛋白磷酸化。免疫共沉淀分析结果显示C-2可以解离Bcl-2/Bcl-xL-Beclin-1复合物,并且JNK抑制剂SP600125逆转了C-2上调的LC3,Beclin-1蛋白的表达与Bcl-2/Bcl-x L-Beclin-1复合物的解离。综上结果可知,C-2通过激活JNK通路解离Bcl-2/Bcl-x L-Beclin-1复合物,诱导膀胱癌细胞发生自噬。5.P62也是细胞自噬过程中非常重要的蛋白,western blot检测发现C-2可以促进BIU87与EJ细胞中P62与p-Nrf2的表达,并且12 h时达到最高。用免疫荧光检测C-2对Nrf2蛋白的影响,结果显示与对照组比较BIU87细胞的核内Nrf2积累增加,说明C-2能够激活Nrf2途径。免疫共沉淀检测结果显示,4μM的C-2处理BIU87细胞6 h,P62与Keap1结合形成复合物,但是12 h结合减少,可得知在C-2作用于膀胱癌细胞的早期阶段,通过上调自噬蛋白P62结合Keap1而激活Nrf2通路。6.进一步探讨JNK通路与P62-Nrf2以及细胞凋亡之间的关系,MTT检测得知JNK抑制剂SP600125能显著增强C-2对膀胱癌细胞的毒作用,并且逆转了C-2上调的P62与p-Nrf2蛋白的表达量以及P62-Keap1复合物的结合,但是进一步增加了C-2上调的凋亡蛋白Active-Caspase3与CF-PARP的表达量。可知,在C-2作用于膀胱癌细胞的早期阶段,JNK上调P62蛋白表达激活Nrf2途径抵抗C-2诱导的凋亡发生,抑制JNK可以使C-2转而促进细胞凋亡。探讨C-2诱导的细胞自噬的作用,MTT检测得知自噬后期抑制剂Baf-A1能降低化合物C-2对膀胱癌细胞的毒作用。Baf-A1进一步增加了C-2上调的P62与LC3蛋白的表达量以及P62-Keap1复合物的结合,逆转了C-2上调的凋亡蛋白Active-Caspase3与CF-PARP的表达量。可知,阻断细胞自噬后期促进P62-Nrf2通路的激活,并且C-2抑制膀胱癌细胞的生长与其诱导的细胞自噬促进凋亡的机制有关。此外,用JNK si RNA与P62 siRNA分别作用于BIU87细胞后,也进一步增加了C-2导致的BIU87细胞死亡,综合可知JNK与P62是C-2作用于膀胱癌细胞的关键调节分子。7.裸鼠移植瘤体内实验研究中,与溶剂对照组比较,C-2抑制EJ膀胱癌细胞移植瘤的生长速度并且对裸鼠的体重无明显影响,表明化合物C-2抗肿瘤效果明显,毒副作用小,具有应用前景。此外,C-2联合SP600125抑制JNK,显示又能进一步增强C-2的肿瘤抑制功效。免疫组化与western blot检测发现C-2可以诱导细胞移植瘤中发生自噬与凋亡,并且联合SP600125凋亡增加,与体外实验一致。综上所述,本文证明了在膀胱癌细胞中,C-2能够促进线粒体途径介导的细胞凋亡,体内抗肿瘤效果显著。此外,揭示了C-2通过JNK激活细胞自噬与P62-Nrf2途径共同调节C-2诱导的细胞凋亡导致肿瘤抑制的一系列分子机制,期望为新药开发提供研究依据与理论支持。