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目的:
分析沈阳地区孕妇血清的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)标志物及HBVDNA，调查沈阳地区孕妇慢性HBV感染的血清学及病毒学特点;高病毒载量的HBV体外感染人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞，探讨HBV宫内感染机制;应用乙型肝炎人免疫球蛋白(human hepatitis B immunoglobulin，HBIG)阻断HBV体外感染人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞的实验研究，为HBIG阻断HBV宫内感染提供理论依据:构建早期胎盘屏障和晚期胎盘屏障，比较HBV穿透早期胎盘屏障和晚期胎盘屏障的能力及研究HBIG阻断HBV穿透早期胎盘能力，提出阻断HBV宫内感染的新策略。
材料与方法:
一、临床部分:
1.研究对象:
选择2010年6月-2011年11月在中国医科大学附属盛京医院产科病房分娩的沈阳地区的孕妇为研究对象。所有的孕妇完善乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis Bs antigen，HBsAg)检测，对于血清HBsAg阳性的孕妇建立档案，留取血清，-20℃冻存。
2.主要试剂:
(1) HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)定量检测试剂盒:雅培，美国。
(2) HBVDNA定量检测试剂盒:罗氏，美国。
3.实验方法:
(1) HBsAg阳性的孕妇血清HBeAg检测:化学发光微粒子免疫法。
(2) HBsAg阳性的孕妇血清HBVDNA检测:实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)。
4.统计学分析:
应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。组间率的比较应用Fishers精确概率法进行统计分析，并计算比值比(odd ratio，OR)和95％可信区间(confidenceinterval，CI)。P＜0.05为差异有统计学意义。
二、体外实验:
1.研究对象:
人胎盘绒毛膜癌BeWo细胞。BeWo细胞及其F-12K细胞培养液购自美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）。当细胞培养处于对数生长期进行实验研究。
2.主要试剂:
(1)血清/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒:北京天根生化科技有限公司。
(2) HBVDNA检测试剂盒:深圳凯杰生物工程有限公司。
(3) HBsAg定量检测试剂盒:雅培，美国。
(4)鼠抗人HBsAg单克隆抗体:北京中杉金桥生物技术公司。
(5)兔抗人乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B cantigen，HBcAg)多克隆抗体:北京中杉金桥生物技术公司。
(6)即用型链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(streptavidin-biotin-enzymecomplex，SABC)免疫组化染色试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。
(7) HBIG:华兰生物工程股份有限公司。
(8) Forskolin(腺苷酸环化酶激活剂):碧云天生物技术研究所。
(9)总β亚单位hCG测定试剂盒:贝克曼库尔特商贸有限公司，美国。
(10)小鼠抗人上皮性钙粘附蛋白单克隆抗体(Mouse anti-E-Cadherin IgG):BD生命科学公司，美国。
(11)异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记山羊抗小鼠IgG:北京中杉金桥生物技术公司。
(12)凯基细胞凋亡4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色试剂盒:凯基生物技术公司。
3.实验方法:
(1) HBV感染BeWo细胞后初代细胞不同时间点和各代细胞内和上清液中HBVDNA检测:实时荧光定量PCR。
(2) HBV感染BeWo细胞后初代细胞不同时间点和各代细胞96 h上清液中HBsAg检测:化学发光微粒子免疫法。
(3) HBsAg和HBcAg在BeWo细胞内的表达:SABC细胞免疫组织化学染色方法。
(4)应用Forskolin诱导BeWo细胞融合:上清液中人绒毛膜促性腺激素(humanchorionic gonadotrophin，hCG)检测、细胞膜和细胞核免疫荧光染色方法。
(5)胎盘屏障建立:BeWo细胞在Transwell(R)细胞培养插入皿的内室培养，Millicell(R)-ERS细胞电阻仪每日测量跨上皮细胞电阻值(transepithelium electricalresistance，TEER)。测量TEER＞100Ω·cm2，即在Transwell(R)细胞培养插入皿的内室中BeWo细胞形成极化、紧密连接的单层细胞，模拟胎盘屏障建立
(6) Transwell(R)细胞培养插入皿外室的HBVDNA检测:实时荧光定量PCR。
4.统计学分析:
应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。HBIG阻断实验中的HBVDNA结果取对数做统计分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示。采用两独立样本均数的t检验和最小显著差异(least significant difference，LSD)法。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
一、临床部分
1.在4536例孕妇中，HBsAg携带率是5.49％(249/4536)。年龄≤20岁孕妇的HBsAg携带率是1.30％(2/154);年龄＞20岁孕妇的HBsAg携带率是5.64％(247/4382)。年龄＞20岁孕妇的HBsAg携带率是年龄≤20岁孕妇的HBsAg携带率的4.5倍。
2.在249例HBsAg阳性的孕妇中，HBeAg阳性和HBVDNA阳性的孕妇占多数。其中HBeAg阳性是167例(67.07％)，HBeAg阴性是82例(32.93％); HBVDNA阳性是204例(81.93％)，HBVDNA阴性是45例(18.07％)。
3.204例HBVDNA阳性的孕妇根据其病毒载量分为3组:低病毒载量组(12IU/ml～50 IU/ml)是11例(4.42％)、中病毒载量组(50 IU/ml～107 IU/ml)是156例(62.65％)、高病毒载量组(HBVDNA≥107 IU/ml)是37例(14.86％)。高病毒载量的孕妇均是HBeAg阳性，HBVDNA阴性的孕妇均是HBeAg阴性。
4.在167例HBeAg和HBVDNA均阳性的孕妇中HBVDNA范围在1.48×101IU/ml～5.62×109 IU/ml，HBVDNA中位数是1.46×108 IU/ml;在37例HBeAg阴性而HBVDNA阳性的孕妇中HBVDNA范围在1.97×101 IU/ml～1.63×106 IU/ml，HBVDNA中位数是7.67×104 IU/ml。
二、体外实验:
1.消化后BeWo细胞于37℃、5％CO2恒温细胞培养箱培养，倒置相差显微镜观察细胞的生长情况:BeWo细胞4h贴壁，24h生长良好、72 h～120 h形成细胞单层。
2.HBV感染BeWo细胞初代各时间点细胞内和上清液中HBVDNA均随时间延长而增加，120h达到高峰;HBV感染BeWo细胞后每96h传代一次，各代细胞内及上清液中HBVDNA均随着传代次数增加逐渐降低，至第5代时消失。
3.HBV感染BeWo细胞初代各时间点细胞的上清液中HBsAg定量随时间延长而增加;感染后1～3代细胞上清液中可以检测到HBsAg，HBsAg定量随代数增加而降低，第4代以后阴性。
4.在1～3代HBV感染BeWo细胞可见HBsAg染色阳性细胞，其胞浆染成弥漫性棕黄色;1～3代HBV感染BeWo细胞可见HBcAg染色阳性细胞，其胞核可见染成棕红色，阴性对照二者染色均阴性。
5.HBIG阻断HBV感染BeWo细胞的实验中:PBS清洗前，A组细胞培养上清液中HBsAg定量检测为阳性，B、C组细胞培养上清液中HBsAg定量检测均为阴性。A、B、C组细胞培养上清液中HBVDNA定量为阳性，组间差异不明显(P＞0.05)。经PBS清洗8次后，各组细胞培养上清液中HBVDNA和HBsAg定量均阴性。PBS清洗后24 h～120 h，A组细胞培养上清液中HBVDNA和HBsAg定量均阳性，且随着时间的延长而逐渐增加;PBS清洗后24 h～72 h，B、C组细胞培养上清液中HBVDNA和HBsAg定量均阴性;PBS清洗后96 h～120 h，B、C组细胞培养上清液中HBVDNA和HBsAg定量均阳性。PBS清洗后120 h时，A组HBVDNA和HBsAg定量分别与B、C组组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而B、C组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）;PBS清洗后120 h，A、B、C组细胞内HBVDNA均是阳性，分别为5.89±0.50 lg copies/ml、3.14±0.02 lg copies/ml和3.59±0.24 lgcopies/ml。
6.Forskolin诱导BeWo细胞融合48 h和72 h时，细胞培养上清液中hCG明显升高，免疫荧光染色可见细胞发生融合，成功模拟早期胎盘和晚期胎盘。
7.BeWo细胞在Transwell(R)细胞培养插入皿中培养72 h可以形成极化、紧密连接的单层细胞，模拟胎盘屏障已建立。
8.HBV穿透早期胎盘屏障多于晚期胎盘屏障，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
9.HBIG能够减少HBV穿透早期胎盘屏障，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:
1.沈阳地区年龄≤20岁孕妇HBsAg携带率较年龄＞20岁孕妇HBsAg携带率有明显的降低，这可能是与沈阳地区自从1988年开始对新生儿乙型肝炎疫苗的普遍免疫预防接种有关;HBsAg阳性孕妇中HBeAg阳性和HBVDNA阳性孕妇占较高的比例，因此在妊娠期间筛查HBsAg是必要的;高病毒载量的慢性HBV感染的孕妇所占的比例不高，因此不必要所有HBsAg阳性的孕妇均抗病毒治疗。
2.HBV可以体外感染BeWo细胞，且能在传代细胞中表达。BeWo细胞可用于进行HBV宫内感染机制的研究。
3.体外实验证实HBIG具有中和HBV及阻断HBV对BeWo细胞感染的作用。妊娠期注射HBIG可能降低HBV的宫内感染机率。
4.HBV宫内感染可能多发生于妊娠早期，在妊娠早期应用HBIG可能阻断HBV的宫内感染。