鸡球虫基于28S rDNA的HRM分子鉴定方法的建立和线粒体基因组遗传变异研究

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鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫引起的鸡肠道病变的疾病,该病的流行给养禽业带来严重的经济损失。目前国际上公认的鸡艾美耳球虫有7种,即柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tellena)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)和早熟艾美耳球虫(E.praecox),所有种的球虫均有不同程度的致病性。本论文以鸡艾美耳球虫不同虫株为研究对象,开展其核糖体28S rDNA及线粒体全基因组的序列测定和遗传变异的分析研究,并应用高分辨熔解曲线(HRM)技术建立了一种基于28S序列分析的不同虫种的分子鉴定方法。  本研究的第一个部分对经单卵囊接种分离法获得的20个鸡艾美耳球虫不同虫株进行卵囊DNA的提取,PCR扩增28S rDNA靠后部分序列,经PCR扩增、克隆和序列分析,结果显示均能扩增出相应的目的条带,种内序列相似性在98.1%~100.0%之间;种间序列相似性在96.6%~99.0%之间。结果表明28S rDNA基因在球虫进化过程中比较保守,但也能作为遗传变异的标记有效地区分不同种的艾美耳球虫。  通过对20个艾美耳球虫虫株的28S rDNA基因序列的比对分析,在种内保守而种间差异较大的序列位置设计高分辨溶解曲线(HRM)技术的引物,优化反应条件,应用该技术对20个艾美耳球虫虫株的靶序列进行了分析,同时就不同样品起始浓度对结果的影响进行了探讨。结果显示,通过高分辨熔解曲线能够有效地鉴定不同虫种,本研究建立了一种基于HRM技术的鉴定艾美耳球虫种类的快速检测方法,为进一步研究艾美耳球虫的分子生物学特征奠定了一定的基础。  本研究的第二部分对巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和早熟艾美耳球虫的线粒体基因组全序列进行了测定和分析,从线粒体基因的角度,开展对艾美耳球虫遗传变异的研究。通过设计的cox1保守引物,成功扩增出线粒体cox1基因部分序列,在此基础上,以长PCR方法扩增了5种鸡艾美耳球虫的线粒体全基因组,获得其线粒体基因组全序列,长度分别为6165 bp、6179 bp、6215 bp、6173 bp和6407 bp,包括3个蛋白质基因(cox1、cox3和cytb)、12个大亚基rRNA基因片段(L-rRNA)和7个小亚基rRNA(S-rRNA)基因片段。与其它相关原虫线粒体全基因序列进行比较分析,研究与分析了其相互的进化关系、结构特点。本研究首次获得巨型艾美耳球虫等5种鸡球虫线粒体基因组全序列,丰富并完善了球虫线粒体基因组的研究资料。
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