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化学农药过量使用导致的虫害耐药性和环境污染问题日益突出,以昆虫病原真菌作为生防农药来防治虫害的策略越来越受到人们的重视。然而,昆虫病原真菌在防治虫害的实际应用中却面临许多问题。原因之一是昆虫病原真菌具有杀虫速度慢、抗逆性差和环境效果不稳定等缺点。因此,需要加强对昆虫病原真菌杀虫机理和遗传操作策略方面的研究,本课题旨在通过对金龟子绿僵菌相关毒力因子的研究,为利用基因工程技术构建工程菌株奠定理论基础。另一方面,转基因高毒力菌株的生物安全性问题也越来越受到人们的重视。近年来,Cre-loxP和Flp-FRT位点特异性重组系统被广泛地用于来解决转基因植物的安全性问题,借鉴相关原理,本课题为了消除转基因真菌使用中的潜在隐患,对这两种重组系统在金龟子绿僵菌中的应用进行了初步探讨。金龟子绿僵菌是一种重要的昆虫病原真菌,作为研究昆虫与病原真菌间相互作用的模型而被广泛地研究,但缺少合适的选择标记一直是制约金龟子绿僵菌遗传操作的一个重要瓶颈。 本研究针对这个问题,开发了以氯嘧磺隆除草剂抗性基因sur为选择标记的根癌农杆菌介导转化体系,该体系的转化效率为80-120个转化子/105个分生孢子。在该系统中,我们将绿色荧光蛋白基因cgfp和氯嘧磺隆抗性基因sur作为选择标记,从而实现了对转化子的高通量筛选。金龟子绿僵菌cag-8基因敲除实验表明该系统可以用于高效地敲除金龟子绿僵菌中的靶标基因。昆虫体壁上覆盖着一层富含烃类物质的蜡质层,其是昆虫抵御病原真菌侵染的第一道防线。然而,病原真菌中有关蜡质层降解的基因却未有报道。在此,我们首次研究了细胞色素P450单加氧酶52家族基因(MrCYP52)在金龟子绿僵菌侵染寄主过程中的作用。我们利用MrCYP52基因启动子控制绿色荧光蛋白的表达来分析不同情况下该基因的表达水平。与其它情况相比,该基因在昆虫体壁上的表达水平显著性提高。在昆虫体壁萃取物、癸烷和长链烷烃存在的情况下,MrCYP52的表达水平可以被不同程度地诱导增加,其中长链烷烃的诱导效果不如癸烷。与野生型菌株相比,基因敲除菌株⊿MrCYP52在昆虫体壁上的萌发率和附着胞分化率都有显著性下降,对大蜡螟的毒力也明显减弱。此外,补充营养物质可以消除MrCYP52基因对孢子萌发和附着胞分化的影响。由此说明,金龟子绿僵菌MrCYP52参与了利用昆虫体壁烃类物质的过程,在昆虫病原真菌侵染寄主的过程中扮演着重要角色。此外,昆虫体壁中的烃类物质可被病原真菌作为重要的营养来源,而并非诱导侵染过程的化学信号。 本研究从金龟子绿僵菌M.robertsii NwIB-02的发酵培养基中分离鉴定出两种大量积累的次生代谢产物,它们分别为烟曲霉酸及其去酰基衍生物,其中烟曲霉酸的产量达到93.5 mg/L。结合金龟子绿僵菌M.robertsii2575表达序列标签库和烟曲霉A.fuimgates293基因组测序信息,我们首次获得了金龟子绿僵菌M.robertsii NwIB-02烟曲霉酸合成基因簇,其中包括9个基因,分别为角鲨烯环化酶、4个细胞色素P450单加氧酶、短链脱氢酶、3-甾酮-1-脱氢酶和2个转移酶。我们通过敲除烟曲霉酸合成过程中的关键基因(角鲨烯环化酶,Mrshc)来阻断烟曲霉酸的合成途径,进而研究烟曲霉酸对金龟子绿僵菌毒力的影响。结果表明,与野生型菌株相比,基因敲除菌株⊿Mrshc丧失了合成烟曲霉酸的能力,但是其对寄主的毒力并不受影响。基于此,我们认为烟曲霉酸及其衍生物并不是金龟子绿僵菌重要的毒力因子,其生物学功能还有待进一步研究。为了消除转基因真菌的潜在安全隐患,我们尝试将Cre-loxP和Flp-FRT重组系统应用于金龟子绿僵菌中,但我们发现Crc-loxP重组系统在金龟子绿僵菌中的剪切效率很低,而Flp-FRT重组系统则不能发挥作用。为了解决这些问题,我们通过添加核定位序列和使用融合识别位点,使得cre重组酶在金龟子绿僵菌中的剪切效率由原来的6％提高到了100％。在此基础上,我们利用昆虫血淋巴特异诱导型启动子Mcll控制cre重组酶的表达,从而实现了Cre重组系统在金龟子绿僵菌中的条件性剪切,并且其剪切效率为100％,这为开发安全型转基因真菌奠定了重要的基础。