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目的:利用大鼠全脑缺血实验和体外小脑皮质神经细胞培养方法,探讨神经生长因子对缺血/缺氧后小脑皮质神经细胞凋亡的防治作用,为临床小脑缺血的治疗提供理论依据。
方法:1.整体动物实验:采用闭塞大鼠四动脉法建立全脑缺血模型,应用光镜、电镜及末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL染色法)观察模型组和NGF治疗组动物脑缺血30min再灌注7d小脑皮层神经细胞凋亡的情况。2.体外小脑皮质神经细胞培养实验:用原代培养的SD大鼠乳鼠小脑皮质细胞,建立了缺氧/缺糖诱导的神经细胞凋亡模型,实验组的各组提前24h加入NGF。通过MTT法测定细胞存活率和细胞代谢情况。检测培养液中LDH含量,反映细胞的功能状态。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。利用HE染色法和TUNEL染色法,通过光学显微镜观察细胞凋亡情况。
结果:1.动物整体实验:模型组小脑皮层神经细胞有明显形态学损伤,TUNEL染色示小脑皮质蒲肯野细胞凋亡率为53.02%。而实验B、C组(NGF1000u/kg,2000u/kg)神经细胞结构损伤明显减轻,凋亡细胞率分别为24.42%和21.92%,较模型组明显减轻(P<0.01)。,2.体外小脑皮质神经细胞培养实验:培养7d的神经细胞换含0.5mmol·L-1连二亚酸钠的无糖Earles液培养48h,可诱导小脑颗粒细胞凋亡。流式细胞仪检测模型组凋亡细胞比例为47%,TUNEL染色发现大量阳性细胞,MTT示细胞存活率下降,培养液中LDH明显升高。细胞形态亦有明显损伤变化。实验B、C组(NGF50,100ug·L-1)能显著降低凋亡细胞数,流式细胞仪示细胞凋亡率分别为18%和15%。同时MTT示细胞存活率升高,培养液中LDH含量明显减少,细胞形态结构损伤明显减轻。结论:给予外源性NGF能够减轻缺血觖氧诱导的大鼠小脑皮质神经细胞凋亡。