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甘蔗(Saccharum officinarum L.)是重要的糖料作物和能源作物,蔗糖分别占世界食糖和我国食糖总产量的70%和90%以上,甘蔗燃料乙醇产量约占世界生物质燃料乙醇总产量的40%。干旱是造成甘蔗等作物减产的重要因素,我国甘蔗85%种植在盐碱地或旱坡地,甘蔗水分需求与供给不平衡的矛盾尤为突出。挖掘甘蔗抗旱基因是甘蔗抗逆性育种的重要基础工作。转录水平调节是作物从分子水平上适应干旱胁迫的一个重要机制,利用干旱胁迫应答基因在转录水平的表达差异来筛选并鉴定抗旱相关基因,是挖掘作物抗旱基因的有效手段。斑茅(Erianthus arundinaceus)是甘蔗近缘属植物,具有优异的抗逆基因资源,已成为甘蔗抗逆育种的重要基因来源。有性杂交虽然也是一种有效的途径,而且,经过了十几年研究,目前也已培育出甘蔗与斑茅杂交的BC3和BC4后代。但是,在斑茅优异的抗逆基因资源的杂交利用与“高贵化”回交过程中,还面临较多的困难,如杂交后代花粉不育、计划杂交的组合花期不遇和优良目标性状的多基因聚合问题,同时,在杂交后代广泛变异群体中,具有优良目标性状聚合基因型单株的鉴定与选择的准确性和效率依然不高。因而,即便对于甘蔗品种间的杂交,一般认为在10万个杂交后代变异群体中,经过10年的鉴定与选择,有希望培育出1个优良栽培品种。基于上述考虑,利用综合性状好且具有斑茅血缘的甘蔗BC2材料,进行模拟干旱逆境胁迫,以期在解析甘蔗应答干旱逆境胁迫分子机理的同时,挖掘重要的抗逆基因和转录调控元件,为后续抗逆育种奠定物质基础、理论依据与技术储备。本研究以甘蔗与斑茅杂交选育的BC2无性系(S. complex)崖城05-179(YCE05-179)为实验材料,采用Illumina GA/HiSeq第二代测序平台进行RNA-Seq高通量测序,通过收集、比对与分析在模拟干旱胁迫条件下(25%PEG800,24h)的甘蔗根中的转录本数据,高通量的分离和筛选差异表达基因,并对部分PEG胁迫应答基因进行了功能验证。主要结果与结论如下：1.以抗旱斑茅蔗无性系YCE05-179为植物材料,基于Illumina/Solexa二代测序平台的RNA-Seq技术,成功获得YCE05-179的根中响应PEG胁迫的转录本序列信息,处理和对照2个样本的测序总量分别达到514,274,992个和556,342,815个总碱基对(Total base pairs);其中,胁迫处理样本得到10,495,408个clean reads,对照样本得到11,353,935个clean reads。测序质量的多重评估分析结果表明,本研究中RNA-Seq测序质量良好,测序深度充分,测序结果已经基本覆盖了2组样本细胞中全部表达的基因。2.以NCBI的高粱基因组数据库以及高粱基因数据库数据为参考,对上述两组RNA-Seq数据进行比对和分析,共检测到23,550个基因。从两组样品中,共筛选到12,035个差异表达基因,其中上调表达的基因有6,480个,下调表达的基因有5,555个。表达显著差异(差异表达基因为FDR≤0.001且倍数差异不低于2倍)的基因共有597个(其中上调表达329个,下调表达268个)。本研究从上述差异表达基因中挑选出部分基因做进一步的功能验证,包括参与细胞次生代谢途径中木质素合成的dirigent蛋白基因、参与重金属绑定和细胞活性氧清除的金属硫蛋白基因,以及参与转录调控的R2R3-MYB转录因子家族基因。3. Dirigent和dirigent-like家族蛋白与植物细胞的木质素合成相关,参与了植物对病原体和非生物胁迫的应答。本研究在对RNA-Seq和甘蔗茎cDNA全长文库数据分析的基础上,分离克隆了1个dirigent-like基因,命名为ScDir (GenBank Accession number:JQ622282)。 ScDir的cDNA全长819bp,包含1个564bp的开放读码框,编码187个氨基酸。ScDir蛋白的氨基酸序列N端的第1到25个氨基酸残基和第7到26个氨基酸残基的位置分别包含一个信号肽和跨膜结构区。用His标签标记ScDir蛋白,并成功在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了该重组蛋白(理论分子量大小为27.4kDa).ScDir基因在大肠杆菌中的表达提高了宿主菌对PEG和NaCl的耐受能力。以GAPDH基因为内参基因的实时荧光定量PCR研究表明,ScDir基因在甘蔗的茎中高度特异表达,其在茎中的相对表达量分别是在根、叶和芽中的8.64±0.48倍,25,635.16±2,966.03倍和721.50±8.17倍。实时荧光定量PCR研究结果表明,H2O2、PEG和NaCl胁迫提高了ScDir基因在甘蔗组培苗中的表达水平,其中ScDir基因的表达受PEG胁迫的诱导而显著上调,在处理12h时间点其表达量最高,为对照的35倍以上。上述实验结果说明,ScDir基因是一种茎高度特异表达基因,该基因在大肠杆菌中的作用及其在甘蔗中的表达模式,揭示了该基因在甘蔗应答干旱、高盐和氧化等非生物胁迫方面起到积极的作用。4.金属硫蛋白基因是一类富含半胱氨酸的小分子量金属结合蛋白。前人的研究显示,植物金属硫蛋白具有可逆结合有毒离子和基本金属离子的能力,在解毒、维持金属离子代谢平衡和调节金属离子转运等方面起重要作用。本研究在对RNA-Seq和甘蔗茎cDNA全长文库数据分析的基础上,分离克隆了一个金属硫蛋白基因,命名为ScMT2-1-3(GenBank Accession number:JQ627644)。ScMT2-1-3基因全长700bp,包含一个240bp的开放读码框,编码79个氨基酸。在大肠杆菌中成功表达了带His标签的ScMT2-1-3重组蛋白(分子量大小约为19.01kDa),并通过MALDI-TOF-TOF MS验证了该重组蛋白。ScMT2-1-3基因在大肠杆菌中的表达提高了宿主菌对Cd2+、Cu2+、PEG和NaCl的耐受能力。实时荧光定量PCR研究表明,CuCl2、H2O2、PEG和NaCl胁迫均提高了ScMT2-1-3基因在甘蔗组培苗中的表达水平,而CdCl2胁迫抑制了ScMT2-1-3基因的表达水平；ScMT2-1-3基因在甘蔗芽和根中的相对表达量是在茎和叶中的14倍以上。ScMT2-1-3基因在大肠杆菌中的作用及其在甘蔗中的表达模式,提示了该基因在甘蔗应答干旱、高盐和氧化等非生物胁迫时,扮演着抗氧化的角色,并起积极的作用。此外,ScMT2-1-3基因还参与了铜离子在细胞中的解毒和富集过程,但其对甘蔗细胞中镉的解毒和富集过程的作用机理还需进一步研究。5.R2R3-MYB基因是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。本研究在RNA-Seq高通量测序的基础上,综合应用电子克隆、RT-PCR和RACE技术,分离克隆了3个甘蔗R2R3-Myb基因/亚家族Sc2RMyb1、 Sc2RMyb2和Sc2RMyb3s。这些基因的表达特性或功能验证实验结果如下：(1)Sc2RMyb1(GenBank Accession number:JQ823165)的基因组DNA全长1,807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1,284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌,经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kDa。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H202和NaCl抑制而明显下调；Sc2RMyb1基因对PEG的应答除了在处理12h时略有上调以外,在其余的6个理处时间点均明显下调。推测该基因作为负调节因子参与了NaCl等胁迫应答相关基因的调控过程。(2)Sc2RMyb2基因通过不同剪接方式,产生至少两种转录本,即Sc2RMyb1和Sc2RMyb2。其中Sc2RMyb2S1的cDNA全长为1,066bp,开放阅读框长度为687bp,共编码228个氨基酸；Sc2RMyb2S2无明显开放读码框,不编码功能蛋白。序列分析表明,串联内含子的结构特征是Sc2RMyb2剪接调控的结构基础。Sc2RMyb2转录基因子基因通过剪接调控,调节细胞中Sc2RMyb2S1和Sc2RMyb2S2两种转录本的相对表达量,从而对PEG胁迫引起的生理生化变化进行应答。实时荧光定量PCR研究表明,Sc2RMyb2S1基因的表达受PEG胁迫的抑制而显著下调,该基因在烟草叶片中的瞬时表达导致叶片变黄,提示了该基因参与了PEG胁迫引起的细胞衰老的调控过程。(3)本研究还分离克隆了Sc2RMyb3s亚家族的7个成员基因(Sc2RMyb3-1～Sc2RMyb3-7),并对Sc2RMyb3-1、Sc2RMyb3-2和Sc2RMyb3-3等3个基因进行了初步的功能验证。在烟草叶片中的瞬时表达实验表明,Sc2RMyb3-1和Sc2RMyb3-2基因没有引起烟草叶色等表型的明显变化,而Sc2RMyb3-3基因在烟草叶片中的瞬间表达导致了叶色明显变黄,这提示了Sc2RMyb3-3基因在细胞衰老等相关生理生化过程中发挥重要的调控作用；Sc2RMyb3s亚家族各成员基因在甘蔗响应环境因子的过程中执行不同的功能,体现了R2R3-Myb转录因子调控机制的复杂性。序列分析表明,氨基酸序列中的C端序列结构在决定甘蔗Sc2RMyb3s转录因子的功能上起到重要的作用。