论文部分内容阅读
14-3-3蛋白是真核生物细胞中一类含量丰富的高度保守的酸性蛋白质。在对家蚕蛹cDNA文库测序过程中获得了Bm14-3-3ζ的基因序列,GellBank登录号为DN236892。用14-3-3ε蛋白基因中高度保守的基因序列搜索家蚕EST文库,将得到的EST序列进行序列比对及序列拼接,最后得到一个包含完整ORF的Bm14-3-3ε蛋白基因的cDNA序列,GenBank登录号为EFll2400。序列分析发现Bm14-3-3ζ蛋白与果蝇14-3.3(蛋白同源性为90﹪,Bm14-3-3ε蛋白与果蝇14-3-3ε蛋白同源性为867﹪。推测Bm14-3-3ζ蛋白的分子量、等电点分别为28.1kDa和4.9,Bm14-3-3ε蛋白的分子量、等电点分别为29.7 kDa和4.7,这些特征与已知的14-3-3蛋白相似。另外多序列比对发现一些14-3-3蛋白家族高度保守的氨基酸残基在家蚕两种14-3-3蛋白中都存在。这些说明我们得到的就是14-3-3蛋白家族的两个成员。将两种14-3-3蛋白基因cDNA序列与家蚕全基因组序列进行比对,发现Bm14-3-3£基因的内含子序列比Bm14-3-3ζ长。
通过相似EST搜索、荧光定量PCR和Western blotting分析了两种14-3-3蛋白在家蚕各个时期的表达以及各个组织的分布。发现Bm14-3-3ζ存在于家蚕各个组织及各个时期,Bm14-3-3ε除了在卵以及头部中没有发现外,在其他组织及时期都有表达;Bm14-3-3ζ的表达量在各个组织及时期均比Bm14-3-3ε高;两种14-3-3蛋白在丝腺中都有大量表达。通过Western blotting和免疫荧光法分析了两种14-3-3蛋白的亚细胞定位,Bm14-3-3ζ蛋白既存在于细胞质中也存在细胞核中,而Bm14-3-3ε蛋白主要位于细胞质中。这些说明Bm14-3-3(可能是组成性表达,而Bm14-3-3ε的表达具有时期和组织特异性,且两种14-3-3蛋白可能对丝腺的基因表调控以及丝蛋白的形成具有重要作用。
Bm14-3-3ζ基因的ORF被克隆到pGEX-4T-1载体中,在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白GST-Bm14-3-3ζ,融合蛋白通过电泳和蛋白酶切进行了验证。以此融合蛋白分析了蛹、丝腺、头部、脂肪体以及肠中:Bm14-3-3ζ的结合蛋白,电泳分析发现在每一个组织中可与:Bm14-3-3ζ蛋白结合的蛋白至少有4个组分,这些组分的大小主要位于28~54 kDa之间,Bm14-3-3ζ在各组织的结合蛋白大小非常相似,这说明Bm14-3-3ζ在细胞的各项生命活动中起着关键作用。