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在过去20~30年间,全球范围内肺癌的发病率和死亡率一直呈现逐步上升的态势,肺癌也已经成为临床最常见的癌症致死因素,根据世界卫生组织的最新调查报告,在世界范围内肺癌的发病率高居恶性肿瘤的第一位。肺癌按照病理类型划分,可以分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC又可细分为若干种病理类型,最常见的包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等,NSCLC的发病率占肺癌总发病率的80%以上。肺癌整体恶性程度较高,现有治疗效果欠佳,无论原发灶的大小,肺癌患者常出现肿瘤转移,并且治疗后复发率很高。目前肺癌的治疗方法包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、免疫治疗和靶向治疗等。尽管众多治疗手段已经被广泛应用于临床,但肺癌的治疗效果仍然不尽理想,总体五年生存率低于15%。近年来肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)学说越来越被学者们所接受,该理论认为,CSCs虽然在数量上只占肿瘤细胞总数很少的比例,但是这些细胞具有无限增殖、自我更新以及多向分化的能力。它们在肿瘤的发生、生长、复发和转移的过程中起到了决定性作用,并且对放化疗有较强的抵抗性,也是肿瘤治疗失败的主要原因。侧群(Side Population,SP)细胞是一类可将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外,在荧光免疫分选时显现弱荧光信号的细胞群。有研究表明,这一类SP细胞能够高表达转运蛋白ABCG2/BCRPI,该转运蛋白定位于肿瘤细胞膜,能够将很多细胞毒性化疗药物泵出细胞外,减轻化疗药物对其造成的伤害,产生耐药性。同时SP细胞大多表达有相应CSCs的标记分子,具有极强的致瘤能力,研究发现其对于放射线的耐受性也较非SP细胞更强。目前在很多肿瘤细胞系中都已经检测到了SP细胞亚群的存在,这一类细胞具有明显的CSCs生物学特性,所以在缺乏显著干细胞分子标记的情况下,SP细胞亚群越来越被多地被当做CSCs来进行研究。近年来,SP细胞分析法已经广泛用于从肿瘤细胞系和原代细胞中分选、鉴定干细胞样细胞。在不同的实验室的癌细胞已传代出很多NSCLC细胞系,但是有研究发现多个实验室从相同NSCLC细胞系中分离SP细胞的比例却呈现很大的差异。还有证据表明,反复传代细胞系常常导致其特性的改变。因此,有理由怀疑不同实验室采用的NSCLC细胞系可能是由于传代数不同造成了实验结果的差异。所以长期传代对于NSCLC细胞中的SP细胞生物学特性和功能特性的影响具有很高的研究价值。本研究将人肺腺癌A549细胞系和术中采集的NSCLC细胞分别进行传代培养,利用基于ABCG2介导的Hoechst 33342染料排斥原理,采用流式细胞技术,分选出早期传代和后期传代细胞系中的SP细胞。进一步研究增加细胞传代数是否可以改变SP细胞的相关生物学特性和功能特性,这可能有助于解释当前有争议的研究结果和更好地了解NSCLC干细胞的生物学特性。第一部分早期/后期传代的原代NSCLC细胞株和A549细胞系中SP细胞的分离、培养和鉴定研究方法1.A549细胞系和NSCLC原代细胞经过不同的传代数(2代和50代)后,采用流式细胞术检测细胞系中是否存在SP细胞,以及对SP细胞进行流式细胞分选。2.在流式细胞术检测过程中,维拉帕米具有显著降低SP细胞分数的特性,利用此种特性鉴定SP细胞。结果1.在A549细胞系和原代NSCLC细胞的各代细胞中均含有类似SP细胞的细胞亚群。分离早期传代(第2代)和后期传代(第50代)细胞系的A549和原代NSCLC细胞株SP细胞成分。利用流式细胞仪检测,结果显示,早期和后期传代的A549细胞系,SP细胞占总细胞数的比例分别为2.78%和2.03%,早期和后期传代的原代NSCLC细胞株,SP细胞占总细胞数的比例则分别5.81%和4.93%。2.在维拉帕米的作用下,4组细胞的SP细胞分数均显著降低。结论1.成功分离鉴定了A549细胞系和原代NSCLC细胞株的早期和后期传代SP细胞亚群。2.原代NSCLC细胞株和A549细胞系经长期传代后,SP细胞分数均呈现下降趋势。第二部分早期/后期传代的原代NSCLC细胞株和A549细胞系中SP细胞的生物学特性的比较研究研究方法1.克隆形成实验,检测早期/后期传代的原代NSCLC细胞和A549细胞系中SP细胞(共4组)增殖能力的差异。2.细胞成球形实验,检测4组SP细胞自我更新能力的差异。3.NOD/SCID小鼠皮下接种成瘤实验,在NOD/SCID小鼠皮下分别移植不同数量级的SP细胞,评估4组SP细胞致瘤能力差异。4.对4组SP细胞干细胞相关基因的表达进行检测。5.肿瘤细胞迁移相关基因的检测,CSCs的迁移和侵袭能力均经常与上皮-间质转化(EMT)相关联。因此,对EMT相关基因如E-cadherin、N-cadherin、Snail和Twist的表达也进行了检测。结果1.早期和后期传代A549细胞系SP细胞克隆形成效率分别为79.81±5.71%和66.84±3.47%(P<0.05)。早期和后期传代的原代NSCLC细胞株SP细胞平均集落形成百分率分别为78.27±2.26%和61.45±3.72%(P<0.05)。2.A549细胞系第2和第50代SP细胞成球率分别为15.70±2.42%、9.45±0.68%(P<0.05);原代NSCLC细胞株上述两值分别为12.46±1.63%、8.08±1.50%(P<0.05)。3.动物实验结果显示,早期和后期传代的A549细胞系中SP细胞分别需要1×104个和1×105个可以成瘤(均为2/3),早期和后期传代的原代NSCLC细胞株中SP细胞分别需要1×102个和1×104个可以成瘤(均为1/3)。两种来源的肺癌细胞,在经过长期传代后,其SP细胞的致瘤率均有明显下降。4.实时荧光PCR分析表明,两种细胞系第2代与第50代SP细胞的胚胎干细胞相关基因的m RNA表达差异无统计学意义(除在A549细胞中Bmi-1表达以外)。5.实时PCR分析表明,在4组SP细胞中,N-cadherin、Snail和Twist的基因表达,第2代SP细胞均高于第50代SP细胞(P<0.05)。对于E-cadherin的表达,在A549细胞系第50代的SP细胞高于第2代(P<0.05),而在原代NSCLC细胞株,早期/后期传代SP细胞则没有统计学意义上的差异。结论1.经过长期传代的两种NSCLC细胞中的SP细胞,其CSCs的功能特性(如致瘤能力、自我更新能力、迁移和侵袭能力等)均明显减弱。2.原代肿瘤细胞和早期传代细胞系的SP细胞可能是CSCs研究的更好材料。第三部分早期/后期传代的原代NSCLC细胞株和A549细胞系中SP细胞的放化疗抵抗性差异研究研究方法1.不同传代数的细胞系中SP细胞对于放射线的反应情况进行比较,采用单击多靶模型计算分析各组SP细胞的N、D0、Dq、SER值,分析其放射敏感性的变化情况。2.不同传代数的细胞系SP细胞对于化疗药物多柔比星的反应性检测比较,分析其化疗药物敏感性的变化情况。3.放化疗诱导的SP细胞凋亡率检测比较,对于多柔比星和电离辐射诱导的早期和后期传代SP细胞凋亡情况进行分析。分别用2Gy放射线照射、500nmol/L的多柔比星的温育作为预处理手段,再检测各组SP细胞凋亡情况进行分析。结果1.无论是A549细胞系(照射剂量8Gy)还是原代NSCLC细胞株(照射剂量6~8Gy),其第2代SP细胞均比第50代SP细胞表现出更高的放射抗拒性。经过2Gy照射后,A549细胞系第2代和第50代细胞存活分数分别为55.84%±1.91%、50.26%±2.24%(P<0.05);NSCLC细胞株第2代和第50代细胞存活分数分别为70.32±1.52%、58.13%±1.21%(P<0.05)。上述放射生物学参数显示第2代比第50代的SP细胞显示出更高的辐射耐受性。第2代细胞的Dq值均显著大于第50代细胞,这表明的SP细胞的亚致死性损伤修复能力随着传代数的增加在减弱。2.SRB测定表明,A549细胞第2代SP细胞相对于第50代SP细胞明显更加抗拒高剂量的多柔比星(1000 n M)(P<0.05);对于低剂量多柔比星的反应性则没有统计学意义的差异。原代NSCLC细胞株,第2代SP细胞相比第50代SP细胞显示出更大的高剂量多柔比星(1000 n M)抵抗性(P<0.05);而在低剂量多柔比星作用下,其差异无统计学意义。3.经过2Gy电离辐射照射后,早期和后期传代A549细胞系SP细胞凋亡率分别为7.94±0.82%和10.32±1.13%(P<0.05)。经过500n M的多柔比星的预温育后,在第2代和第50代细胞凋亡率分别为22.76±2.81%和27.95±3.17%(P<0.05)。在早期和后期传代NSCLC细胞株中也观察到类似的结果,后期传代SP细胞的凋亡率高于早期传代的SP细胞(P<0.05)。结论1.不同传代数NSCLC细胞的SP细胞成分显示了不同的多柔比星和放射线敏感性。2.两种来源的NSCLC细胞经过长期传代后SP细胞的放化疗抵抗性均明显下降。