【摘 要】
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本文以草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为靶标病原菌,采用稀释法,从农田土壤中分离得到一株对其有较强拮抗作用的菌株Loq18,经形态观察、生理生化及分子鉴定确定为一株枯草芽
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本文以草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为靶标病原菌,采用稀释法,从农田土壤中分离得到一株对其有较强拮抗作用的菌株Loq18,经形态观察、生理生化及分子鉴定确定为一株枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)。Loq18菌株除菌发酵液具有抗菌活性,根据其对草莓灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的毒力方程,得最小抑菌浓度(MIC)为20.48mg/mL。除菌发酵液经硫酸铵沉淀得具抗菌活性的粗蛋白,除蛋白后上清液不具抗菌活性,确定其抗菌活性物质主要为胞外分泌蛋白。为初步了解此抗菌粗蛋白的理化性质,分别研究了温度、pH变化、UV照射、有机溶剂和蛋白酶对其稳定性的影响。实验结果显示,该抗菌粗蛋白具有良好的热稳定性,121℃高压灭菌处理20min后仍具有对照活性的95%以上;对酸碱不敏感,pH值4~11范围内活性相对稳定;对紫外线稳定,在紫外光下照射10h以上时,其活性基本不受影响;经乙醚、丙酮等有机溶剂处理后仍具有对照活性的90%以上;对部分蛋白酶较稳定。抗菌粗蛋白经Sephadex G-75柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-25脱盐,纯化获得抗菌蛋白LP18。利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)、双缩脲反应和茚三酮反应、氨基酸组成分析、脂基和糖基检测对纯化蛋白进行鉴定。结果表明抗菌蛋白LP18是多亚基蛋白,亚基分子量为4283.7 Da,由Leu、Glu、Asp等14种氨基酸组成,含肽键及α-氨基酸,不含脂基和糖基。以实验室所保存的多种病原菌为靶标,检测抗菌蛋白LP18抗菌活性。结果表明,抗菌蛋白LP18对水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、玉米弯胞病菌(Curvularia lunata)等多株植物病原真菌均有较强拮抗活性,具有防治多种植物真菌病害的应用前景。经抗菌蛋白LP18作用后的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)显微观察结果显示,其抗菌机理可能是通过溶解细胞壁及改变细胞膜透性导致原生质渗漏,从而使菌丝断裂或畸形,同时抑制孢子的萌发。
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